脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、外科大手术后等常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，已成为临床危重患者的重要死亡原因。越来越多的研究表明，内皮细胞在LPS引起的内毒素休克、多器官功能衰竭等病理过程中起着关键的作用。因此，深入研究LPS激活内皮细胞机制具有非常重要的意义。与巨噬细胞等髓样细胞不同，内皮细胞不表达mCD14，LPS对其的激活需要LBP和sCD14的参与，加之CD14缺乏跨膜区和胞浆内段，不能直接和细胞内进行信号交流，强烈提示内皮细胞膜上存在跨膜信号分子或跨膜受体。发现并鉴定内皮细胞上的跨膜信号分子，是深入理解LPS激活／损伤内皮细胞机制的关键。新近发现并广为研究的TLR4给上述研究带来了新的机遇。研究表明：TLR4是LPS的受体或信号转导分子，在LPS的病理生理效应中具有重要作用。那么，人内皮细胞是否表达TLR4?如果表达，它是否在LPS激活内皮细胞和信号转导通路中的具有重要作用?TLR4是不是人们长期探索的内皮细胞上LPS的Rt?如果它在LPS激活内皮细胞和信号转导通路中具有重要作用，则可以此为靶，探讨可溶性受体的拮抗效应。对此问题的研究，国内外很少报道。目前研究手段主要采用基因转染、基因突变以及基因敲除等技术，存在表达量低、技术难度较高、不易掌握的缺点。有报道运用抗体的手段进行研究，但多为多克隆，存在着针对性不强等问题。所以单克隆抗体的制备就成为急待解决的问题。 因此，本研究在制作抗人TLR4单克隆抗体的基础上，观察了人内皮 细胞TLR4的表达及LPS对其表达的影响，并对TLR4在LPS激活内皮细 胞和信号转导通路中的作用进行了初步研究；最后，克隆了TLR4的胞外“区，利用毕赤酵母表达系统对其初步表达。旨在为TLR4的相关研究提供 充足的研究材料，初步阐明TLR4在LPS激活／损伤内皮细胞机制和信号 转导通路中的作用。为深入研究和阐明LP S作用机理奠定基础和最终在 细胞受体水平为阻断LPS对内皮细胞的激活／损伤和G”菌脓毒症、脓毒性 休克的防治提供新靶点和新途径。 主要结果及结论如下： 一、预测的B细胞优势表位为＊＊R4＊89工02＞ ＊＊2－＊＊L＊＊R NNNNF。DSL NV．COOH，经毛细管电泳分析合成多肽的纯度达98二％。该表位多 肽能诱发小鼠产生抗TLR4抗血清，其效价为 1：32至 1：128，该多抗能 特异识别TLR4阳性细胞。表明以此制作抗人TLR4单克隆抗体是可行的。 二、经细胞融合和ELISA筛选，建立了能稳定分泌TLR4单抗的杂 交瘤细胞B4。制备了B4的培养上清和腹水，间接ELISA测定抗体效价， 培养上清为1：64～1：256，腹水的效价为1：10 00o。84分泌的抗体为ig＊2， K型，可特异识别TLR4阳性细胞，并具有阻断活性。表明成功制备了抗 人TLR4单克隆抗体。 三、RT．PCR和 Western blot检测结果显示，人内皮细胞能表达 TLR4mRNA和TLR4蛋白，LPS能明显上调其表达水平，并呈时间和剂 量依赖性。初步说明TLR4在LPS激活内皮细胞效应中具有重要作用。 四、转染TLR4的功能突变体和运用抗人TLR4单克隆抗体后，LPS 对内皮细胞激活效应明显减弱，表现为 NF－K B活性明显降低，呈剂量依 赖性。进一步提示，TLR4在LPS对内皮细胞激活效应中具有重要的地位， 很可能为内皮细胞上LPS作用的受体／信号转导分子。 五、TLR4介导LPS对内皮细胞激活具有CD依赖性，同时，SCD14 可明显上调LPS对转染TLR4的293细胞NF。B激活，初步说明TLR4 与 CD间可能存在相互作用。成功构建了 TLR4胞外区和 CD的酵母 ·IX· ＼’表达载体，转化酵母Y187后，发现它们本身无自发激活活性，对酵母细胞也无毒性。酵母双杂交体系的实验结果表明，TLR4与 CD间存在相互作用。初步提示这可能为LPS跨膜信号转导的一种模式，为深入研究LPS的跨膜信号转导机理奠定了基础。。 六、成功构建了pPICgK1LR4酵母表达载体，经酶切和测序鉴定完全正确。电转化GS酵母菌后，经MD／His和G418筛选。共获得了200多个高拷贝菌株，并对其中的几个克隆进行PCR鉴定。结果表明，TLR4的胞外区基因完全整合到酵母菌中。 七、运用毕赤酵母初步表达了可溶性TLR4，SDS－PAGE电泳初步鉴定分子量约66kD，与TLR4胞外区蛋白的分子量一致，表明成功表达了TLR4可溶性受体，为进一步的筛选、表达、纯化和功能研究奠定了坚实。的基础。