表皮蛋白是昆虫表皮的重要组成成分,对昆虫的生长发育起着关键作用。双叉犀金龟是铁皮石斛的一种重要害虫,其头角是一种抗形变和抗断裂的轻质材料,具有较好的刚性和韧性,但对其表皮蛋白的研究较少。本论文选取双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus体内高丰度表达的表皮蛋白基因Td14144和Td35287,通过对两者进行基因克隆、表达纯化及性质表征,明确其功能重要性,为双叉犀金龟表皮蛋白的研究提供依据。根据本课题组双叉犀金龟转录组测序数据,利用PCR获得Td14144与Td35287表皮蛋白基因,并用生物信息学方法分析蛋白序列特征。Td14144和Td35287均属于CPR＿RR-2家族表皮蛋白,具有保守的R&R结构域。随后将基因片段与pET-28a载体同源重组,构建表达载体p ET28a-14144、p ET28a-35287,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中原核表达。Td14144蛋白基因编码区708bp,相对分子质量22k D,为可溶性表达;利用金属螯合层析对其进行分离纯化,平均收率为10 mg/L。Td35287基因编码区1131bp,相对分子质量40k D,为包涵体表达;使用包涵体洗涤的方法对重组蛋白进行分离纯化并缓慢复性,平均收率为15 mg/L。利用几丁质结合实验评估表皮蛋白与不同类型几丁质结合的能力。Td14144和Td35287蛋白均可以与壳聚糖、α-几丁质、β-几丁质和胶体几丁质结合。其中Td14144主要与壳聚糖和α-几丁质结合,Td35287则与α-几丁质的结合能力最强。Td14144蛋白具有低临界溶液温度相变行为,浓度在0.5mg/m L以上且置于室温环境时,蛋白溶液发生自凝聚。动态光散射及圆二色光谱表明蛋白在温度相变过程中进行了一定的自组装。Td35287蛋白与壳聚糖的相互作用产生了液液相分离现象,导致蛋白自身的二级结构发生动态变化,从而实现其与壳聚糖更好的结合。最后利用相分离蛋白与壳聚糖混合制备蛋白-壳聚糖复合膜并进行机械性能表征。结果表明Td14144和Td35287蛋白与壳聚糖相互作用所制备的复合膜,其极限拉伸强度和杨氏模量与纯壳聚糖膜相比均有所提高,显著增加了膜的强度和刚性。本研究为RR-2亚族表皮蛋白提供了新的基因资源,也进一步表明CPR家族在昆虫表皮蛋白中的重要作用。同时有助于了解昆虫表皮的结构功能和在发育过程中所承担的角色,并为优质仿生材料的开发及双叉犀金龟的生物防治提供了新思路。