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本研究将大黑花芸豆种子经匀浆、浸取、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱、阳离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛层析得到凝集素样品。经SDS—PAGE检测显示单一蛋白带，分子量约为28kD，SephacrylS-100凝胶过滤测得其表观分子量约为56kD，表明PML是由两个相同亚基组成的蛋白。性质研究发现PML具有强的兔血细胞凝集素活性；糖抑制实验结果显示盐酸氨基葡萄糖，蔗糖对PML的凝血活性有很强的抑制作用，而麦芽糖，半乳糖和D-果糖对其活性有一定程度的抑制。295nm激发时，天然PML的最大荧光发射峰在327nm处，比游离Trp的最大荧光发射峰348nm蓝移了21nm，说明Trp周围的极性较弱，并未完全暴露于周围溶剂中。280nm激发时，其最大荧光发射峰也在327nm处，荧光强度增加，说明PML的内源荧光发生了从Tyr到Trp的能量转移。研究了不同温度、pH和变性剂对PML凝血活性的影响和荧光光谱的变化，当温度达80℃时，活性完全丧失；pH为4—9对活性影响不大，pH低于2和pH高于12时，大黑花芸豆凝集素的凝血活性大部分丧失；高温和强碱对荧光光谱有较大影响，表明PML对高温，强碱的耐受性不强。NBS修饰Trp过程中，荧光强度明显降低，最大发射波长开始并没有明显变化。计算表明大约有3个色氨酸残基位于PML分子表面，这3个色氨酸残基的修饰导致PML的凝血活性逐渐降低直至完全丧失，表明它们与PML凝血活性的维持有及其重要的作用。丙烯酰胺对PML中Trp淬灭程度达到83％，KI能淬灭PML分子中49％的Trp残基的荧光。用荧光光谱法研究了两种变性剂脲和盐酸胍在不同浓度下对PML构象和凝血活性的影响。盐酸胍较脲可产生更强的变性作用。关键词：大黑花芸豆凝集素；分离纯化；化学修饰；变性剂；荧光光谱；荧光淬灭本文采用同源克隆的方法，通过对玉竹RNA的提取，反转录成cDNA，从Genbank上比较已登录的百合科凝集素的序列，找出其保守序列，并结合软件设计了简并引物，进行3RACE末端快速扩增，得到了3端的部分序列，然后根据已得到的序列设计特异性引物，应用在cDNA的3端随机添加若干PolyA的方法，在cDNA模板3端加上PolyA，再以此为模板进行PCR，从而克隆得到了玉竹5端的部分序列，将3与5序列合并，就能获得cDNA全长序列。
以获得的全长cDNA序列和推导出的氨基酸序列与百合科其他植物凝集素在进行比较，可知玉竹的全长cDNA序列由529个核苷酸组成，开放阅读框长474bp，编码157个氨基酸。通过序列的测定，发现POL基因均编码前体蛋白：含有信号肽序列、成熟蛋白序列和C-末端剪切序列。该成熟蛋白由91个氨基酸组成，分子量约为14kD。该成熟蛋白编码氨基酸序列与囊丝黄精凝集素同源性为60.9％，多花黄精凝集素58.7％，雪花莲凝集素为44.0％，蜘蛛抱蛋凝集素结构域1为43.2％，蜘蛛抱蛋凝集素结构域2为52.6％，麦冬凝集素为75.9％。在blocks数据库(www.blocks.fhcrc.org)中检索POL 蛋白氨基酸序列的结构域，发现POL氨基酸序列中存在两个凝集素功能结构域区，并具有2个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY)。成熟蛋白序列中，疏水氨基酸占39.6％，亲水氨基酸占42.9％，碱性氨基酸占9.9％，酸性氨基酸占7.7％。此基因的克隆，为深入研究POL结构基因，剪切机制，表达和调控机制以及POL结构和功能的关系奠定了重要的基础。