肺癌是目前患病率、死亡率均较高的一种癌症,肺癌的治疗手段多为传统的放化疗以及手术切除,这些方式往往在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤了正常组织,对患者身体造成极大的伤害。中药作为我国临床治疗肺癌的主要手段之一,在临床上与化疗药物合用以证明可减毒增效、延长生存期和生存质量。中药莪术是姜科植物蓬莪术、广西莪术和温郁金的干燥根茎。味辛、苦、温,归肝、脾经,具有行气破血、消积止痛之功。β-榄香烯和姜黄素分别是莪术中挥发油类成分和姜黄素类成分的代表,这两种药物单独对癌症的研究很多,本课题将β-榄香烯和姜黄素配伍应用,探究两药抑制肺癌细胞生长的协同作用。进而与临床抗癌一线药物多西他赛联用,共同探究中西药对肺癌细胞的协同抑制作用。脂质体由磷脂组成,在水中磷脂分子亲水头部插入到水中,疏水尾部则伸向空气,搅动后形成双层磷脂分子的球形囊泡,可将药物包封于双分子层内提高药物的稳定性同时降低药物的毒性。脂质体在体内会被巨噬细胞吞噬,集中在肺部等器官,具有靶向性、细胞亲和性和组织相容性。由于药物包封在脂质体内部,在靶组织释放缓慢,具有一定的缓释性,可以弥补β-榄香烯和姜黄素在体内代谢过快的情况。因此将β-榄香烯和姜黄素制成复方脂质体,以达到靶向、缓释等效用。雾化吸入给药对于治疗肺部疾病有很好的疗效,可以将药物直接递送到靶器官,可进一步提高靶向性,同时避免肝脏首过效应。中医理论中提到"肺为娇脏",是对肺的生理病理特征的概括。肺部具有大量肺泡,肺泡是由单层上皮细胞构成的半球状囊泡,周围还有许多毛细血管,非常利于药物的吸收,但同时也容易受到刺激。因此雾化吸入给药的安全性需要保证,本文对脂质体的雾化吸入刺激性做了初步评价。1.β-榄香烯和姜黄素最佳配伍比例的确定首先建立了稳定的人肺癌细胞A549细胞和鼠肺腺癌细胞LLC细胞的体外传代和培养方法。MTT法的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶—甲臜(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲臜,并通过酶联免疫检测仪测定其吸光值,即可间接反映活细胞数量。通过MTT法研究不同浓度β-榄香烯和姜黄素单独及配伍对两种细胞的生长抑制作用。采用金氏公式(q=(EA+B)/(EA+EB-EA × EB))来评价药物联用的协同作用,q值越大,协同作用越明显。最终通过两药与多西他赛联用后协同作用的大小确定β-榄香烯和姜黄素的最佳浓度配伍比例为1:4。当β-榄香烯浓度为10 mg·L-1、姜黄素浓度为40 mg·L-1、多西他赛浓度为800 mg.L-1时,三种药物联用对LLC细胞的抑制率可达87.44%。2.β-榄香烯-姜黄素复方脂质体的制备与评价以确定的最佳配伍比例将β-榄香烯和姜黄素制成复方脂质体。首先建立复方脂质体中β-榄香烯和姜黄素的含量测定方法。通过单因素考察筛选出三因素三水平,以β-榄香烯和姜黄素的包封率和载药量为指标,利用效应面法进行优化处方。采用Design-Expert.8.05b软件,利用Box-Behnken法优选出最佳处方为姜黄素20 mg、β-榄香烯5 mg、卵磷脂666.7 mg、胆固醇133.3 mg,最终采用pH7.0的磷酸缓冲盐10 mL旋转水化。验证实验结果显示β-榄香烯包封率为(97.86±1.53)%、姜黄素包封率为(97.71±1.53)%,总载药量为(0.1925±0.006)%。制得的脂质体外观呈黄色,分散均匀无沉淀,微观形态呈球形,大小均匀。复方脂质体粒径为(232.0±6.4)nm,电位为(0.71±0.1)mV。通过细胞实验将复方脂质体和溶液剂分别与多西他赛联用,对比结果显示复方脂质体在较高浓度多西他赛时对LLC细胞的生长抑制率显著高于溶液剂(P<0.05)。3.脂质体雾化吸入刺激性的研究由于制得的β-榄香烯-姜黄素复方脂质体载药量较小,考虑采用雾化吸入给药方式。为考察脂质体雾化吸入后对肺部的刺激性,设计大鼠雾化吸入实验,采用自主研发的雾化吸入装置(专利号:ZL201520442646.5)按临床折算剂量对大鼠进行雾化吸入给药。以生理盐水为对照,比较β-榄香烯和姜黄素脂质体对大鼠的肺部刺激性,通过肺部组织HE染色切片和肺泡灌洗液进行BCA总蛋白的含量和乳酸脱氢酶活力进行评价。结果显示,无论是病理切片的观察还是肺泡灌洗液的分析结果均显示β-榄香烯和姜黄素脂质体组与生理盐水组无显著性差异(P>0.05)。初步表明两药脂质体对大鼠的肺部无显著刺激性,为后期研究奠定了基础。