背景与目的：　　新生儿缺氧缺血性脑损伤是围产期窒息所致中枢神经系统损伤的严重疾病，死亡率高，存活者易发生神经精神发育障碍等后遗症。新生儿缺氧缺血性脑损伤发病机制十分复杂，且目前临床上缺乏特效治疗方案。因此，需要深入研究新生儿缺氧缺血性脑损伤发病机制，并寻找新的、有效的治疗方法。在多种中枢神经系统损伤动物实验中，二甲双胍已被证实具有神经保护作用。本研究旨在探究二甲双胍是否对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有神经保护作用，其神经保护作用是否与减轻炎症反应、抑制凋亡、保护血脑屏障有关。　　方法：　　1.动物模型及分组　　（1）分组：选取生后7天的SD大鼠建立缺氧缺血性脑损伤的动物模型。将102只生后7天的SD大鼠随机分为假手术组（Sham组，n=30只）、缺氧缺血组（HI组，n=36只）和缺氧缺血+给药组(HI+Met组，n=36只)。　　（2）动物模型制作：生后7天的SD大鼠乙醚麻醉后，将其左侧颈总动脉结扎并剪断。新生大鼠放回母鼠身边恢复2小时后，将其放置于通有8%氧气和92%氮气的缺氧箱中，保持空气湿度，并将缺氧箱置于37℃水浴箱中恒温缺氧2.5小时。假手术组的大鼠左侧颈总动脉游离暴露后不结扎剪断，也不缺氧。　　（3）给药途径和方式：在造模结束后，HI+Met组大鼠立刻皮下注射二甲双胍溶液（20mg/kg），随后每天一次，连续7天；而Sham组和HI组大鼠立刻皮下注射同药物体积的无菌生理盐水，随后每天一次，连续7天。　　2.检测指标　　2.1.二甲双胍对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用：　　（1）TTC染色法检测脑缺血梗死情况；　　（2）干湿重比法测定脑组织含水量；　　（3）HE染色法和Nissl染色法观察脑组织病理改变及Nissl体变化情况；　　（4）观察脑组织大体情况；　　（5）免疫组化染色和蛋白质印迹法检测脑组织内MBP和MAP-2蛋白表达情况。　　2.2.二甲双胍在新生大鼠缺氧缺血脑损伤保护中抑制炎症反应的研究：　　（1）免疫荧光染色观察海马与皮层部位小胶质细胞和星形胶质细胞的活化情况；　　（2）Real-Time PCR法检测海马与皮层部位炎症因子的基因表达情况；　　（3）蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测海马与皮层部位炎症因子的蛋白表达情况；　　（4）蛋白质印迹法检测TLR4/NF-κB信号通路的蛋白表达情况。　　2.3.二甲双胍在新生大鼠缺氧缺血脑损伤保护中抗凋亡作用的研究：　　（1）Tunel染色观察海马与皮层部位神经细胞的凋亡情况；　　（2）蛋白质印迹法检测海马与皮层部位凋亡相关蛋白的表达情况。　　2.4.二甲双胍在新生大鼠缺氧缺血脑损伤中血脑屏障修复的研究：　　（1）蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测海马与皮层部位周细胞标记蛋白的表达情况；　　（2）蛋白质印迹法检测海马与皮层部位的紧密连接和粘附连接蛋白的表达情况。　　结果：　　1. 二甲双胍对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有显著的神经保护作用：　　（1）TTC染色法检测大鼠脑缺血梗死情况　　脑组织TTC染色结果显示，缺氧缺血后24h，HI组大鼠平均脑梗死体积为（48.12 ± 14.79）%；而HI+Met组大鼠平均脑梗死体积为（12.07 ± 3.40）%，较HI组显著减少（P＜0.01）。　　（2）脑组织含水量测定　　造模后24h的大鼠脑组织含水量测定结果显示，Sham组、HI组和HI+Met组大鼠的脑组织含水量分别为（83.28 ± 1.75）%、（88.79 ± 2.41）%和（84.26 ± 1.83）%。HI组脑组织含水量相比于Sham组明显升高（P＜0.01）。与HI组相比， HI+Met组脑组织含水量明显降低（P＜0.05）。　　（3）观察脑组织的大体情况　　大鼠脑组织大体情况显示，缺氧缺血后7d，HI组大鼠的损伤侧大脑半球表现为明显的脑组织融解和塌陷，且较对侧大脑半球萎缩。而HI+Met组的脑萎缩及脑组织损伤程度较HI组减轻。　　（4）HE染色和Nissl染色的方法观察脑组织病理改变及Nissl体变化情况　　脑组织HE染色结果显示，造模后7d，Sham组大鼠大脑皮层、海马（CA1、CA3和DG）区域结构完整，细胞形态正常、排列整齐、层次清晰。HI组的大脑皮层和海马区域细胞缩小、细胞核致密、细胞变性和细胞排列紊乱。然而， HI+Met组细胞层次相对清晰，排列较整齐，且异常细胞数较HI组显著减少。　　脑组织Nissl染色结果显示，造模后7d，缺氧缺血性损伤导致大脑皮层、海马（CA1、CA3和DG）区域细胞缩小、细胞核皱缩、Nissl体缺失等。而缺氧缺血后给予二甲双胍治疗能明显减少变性及死亡神经元的数量。　　（5）免疫组化染色和蛋白免疫印迹法检测脑组织MBP和MAP-2的蛋白表达情况　　免疫组化染色结果显示，造模后7d，HI组中MAP-2标记的脑皮质相对缺损面积为(53.44 ± 6.91)%，HI+Met组为(16.97 ± 5.30)%。HI组中MBP所标记的脑白质相对损伤面积为(65.96 ± 3.88)%，HI+Met组为(23.10 ± 1.37)%。HI+Met组的MBP和MAP-2阳性区域的损伤较HI组均显著减少（P＜0.05）。　　造模后7d，蛋白免疫印迹结果显示，HI组脑组织内的MBP和MAP-2蛋白表达均显著低于Sham组（P＜0.01），而HI+Met组脑组织内的MBP和MAP-2蛋白表达均明显高于HI组（P＜0.05）。　　2.二甲双胍减轻了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时脑内的炎症反应：　　（1）免疫荧光染色检测海马与皮层部位小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况　　造模后24h的脑组织Iba-1的免疫荧光染色结果显示，Sham组脑组织内可见少量的小胶质细胞。缺氧缺血导致海马与皮层部位标记Iba-1的阳性细胞数显著增多，而HI+Met组的阳性细胞数较HI组显著减少(P＜0.05)。　　脑组织GFAP的免疫荧光染色结果显示，在Sham组脑组织内可见数个星形胶质细胞。在缺氧缺血后24h，我们发现海马与皮层部位标记GFAP的阳性细胞数显著增多，而HI+Met组的阳性细胞数较HI组显著减少(P＜0.05)。此外，GFAP的蛋白免疫印迹结果与免疫荧光染色结果相一致，HI组海马与皮层部位的GFAP表达量均多于Sham组（P＜0.01），而HI+Met组GFAP表达量较HI组均有所下降（P＜0.01）。　　（2）Real-Time PCR法检测海马和皮层部位炎症因子的mRNA表达情况　　海马部位炎症因子mRNA的检测结果显示，造模后24h，HI组IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2、IL-18和iNOS的mRNA表达量相对于Sham组分别上升了(3.68 ± 0.40)倍，(4.57 ± 0.20)倍，(8.26 ± 1.32)倍，(2.33 ± 0.08)倍，(4.62 ± 0.55)倍和(2.92 ± 0.34)倍（P＜0.05）；而给予二甲双胍后IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2、IL-18和iNOS的mRNA表达量相对于Sham组的倍数下降至(1.42 ± 0.09)倍，(1.37 ± 0.06)倍，(1.77 ± 0.19)倍，(1.28 ± 0.06)倍，(1.65 ± 0.14)倍和(1.42 ± 0.05)倍（HI组vs. HI+Met组，P＜0.01）。　　皮层部位炎症因子mRNA的检测结果显示，造模后24h，HI组IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2、IL-18和iNOS的mRNA表达量相对于Sham组分别上升了(2.43 ± 0.14)倍，(2.98 ± 0.38)倍，(4.49 ± 0.60)倍，(3.29 ± 0.39)倍，(3.00 ± 0.24)倍和(3.55 ± 0.41)倍（P＜0.05）；而给予二甲双胍后IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2、IL-18和iNOS的mRNA表达量相对于Sham组的倍数下降至(1.47 ± 0.09)倍，(1.20 ± 0.06)倍，(1.51 ± 0.11)倍，(1.48 ± 0.09)倍，(1.44 ± 0.03)倍和(1.58 ± 0.17)倍（HI组vs. HI+Met组，P＜0.01）。　　（3）免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测海马与皮层部位的TNF-α和IL-6的蛋白表达情况　　造模后24h，Sham组海马与皮层部位基本上观察不到TNF-α、IL-6的绿色荧光。而TNF-α和IL-6的荧光强度在HI组海马与皮层部位明显增强。相比于HI组，Met+HI组海马与皮层部位TNF-α和IL-6的荧光强度显著减弱（P＜0.05）。　　TNF-α的蛋白免疫印迹结果与免疫荧光染色结果变化规律一致，HI组的脑组织海马和皮层部位TNF-α蛋白表达量均明显多于Sham组（P＜0.01）。而二甲双胍治疗后显著下调TNF-α的蛋白表达（P＜0.05）。　　（4）蛋白质印迹法检测TLR4/NF-κB信号通路的蛋白表达情况　　造模后24h，HI组脑组织海马和皮层部位的TLR4蛋白表达较Sham组显著上调（P＜0.05），而给予二甲双胍后表达显著减少（P＜0.05）。造模后24h，HI组脑组织海马和皮层部位的NF-κB蛋白表达较Sham组显著增加（P＜0.01），而给予二甲双胍后表达有明显减少（P＜0.05）。造模后24h，HI组脑组织海马和皮层部位的IκB-α蛋白表达较Sham组明显减少（P＜0.001），而给予二甲双胍后IκB-α的表达有明显回升（P＜0.01）。　　3. 二甲双胍在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护中的抗凋亡作用：　　（1）Tunel染色观察大脑海马与皮层部位的细胞凋亡情况　　脑组织Tunel染色结果显示，Sham组的大脑皮层和海马部位中偶有数个凋亡细胞；但是缺氧缺血后24h，皮层和海马部位中可发现大量的凋亡细胞。相比于HI组，我们观察到给予二甲双胍后凋亡细胞数量显著减少（P＜0.05）。　　（2）蛋白质印迹法检测海马及皮层部位细胞内凋亡相关蛋白的表达情况　　通过蛋白质印迹对造模后24 h的脑组织凋亡相关蛋白进行检测。缺氧缺血后皮层和海马部位内的Cleaved caspase-3蛋白表达增加（P＜0.01），二甲双胍治疗后减少了Cleaved caspase-3的表达（P＜0.05）。缺氧缺血后海马和皮层部位内的Bax蛋白表达水平较Sham组明显升高（P＜0.05），二甲双胍治疗明显下调了Bax蛋白表达水平（P＜0.05）。缺氧缺血后海马和皮层部位内的Bcl-2蛋白表达水平显著降低（ P＜0.01 ），二甲双胍显著上调了脑损伤后的Bcl-2蛋白表达水平（P＜0.05）。　　4. 二甲双胍在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护中的维持血脑屏障完整性的作用：　　（1）免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测海马及皮层部位周细胞标记蛋白的表达情况　　免疫荧光染色结果显示，缺氧缺血后24h，脑组织海马和皮层部位可发现PDGFR-β 和 desmin 标记的周细胞绿色荧光强度显著减弱。而 Met+HI 组PDGFR-β 和desmin的荧光信号较HI组明显增强（P＜0.05）。蛋白质印迹法结果显示，HI组脑组织海马和皮层部位内PDGFR-β 和desmin的蛋白表达较Sham组明显降低（P＜0.05）；与HI组相比，Met+HI组PDGFR-β 和desmin蛋白表达显著升高（P＜0.05）。　　（2）蛋白质印迹法检测海马与皮层部位的紧密连接蛋白和粘附蛋白的表达情况　　正常情况下，脑组织有较多的紧密连接蛋白（Occludin和Claudin-5）表达。造模后24h，HI组脑组织海马和皮层部位的紧密连接蛋白降解明显（P＜0.05），而给予二甲双胍后紧密连接蛋白降解显著缓解（P＜0.05）。　　正常情况下，粘附连接蛋白（P120、β-Catenin和VE-Cadherin）在脑组织内高表达。在造模后24h，HI组脑组织皮层和海马部位的粘附连接蛋白大量降解（P＜0.01），而给予二甲双胍后粘附连接蛋白降解明显减少（P＜0.05）。　　结论：　　1.二甲双胍能够减少脑梗死体积，缓解脑水肿；促进脑组织形态学恢复，减少缺氧缺血导致的大脑组织神经元凋亡、脑白质和脑灰质损伤。　　2.二甲双胍通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来减轻缺氧缺血后脑内的炎症反应；同时部分抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活；下调促炎因子的分泌。　　3.二甲双胍能够抑制新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后的凋亡反应。　　4.二甲双胍能够对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后血脑屏障的破坏起到修复作用。　　5.造模后给予二甲双胍能够对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤起到神经保护作用，这种保护作用主要通过减轻炎症反应、抑制凋亡和保护血脑屏障来实现。