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细胞代谢过程中,线粒体通过氧化磷酸化为机体供能,其中最为重要的底物之一就是氧气,在细胞存活的调节中至关重要。研究证实适度的缺氧诱导细胞过度增殖促进其存活,而极度的缺氧诱导细胞死亡。不同氧浓度下细胞代谢变化的研究有助于对机体适应性调节机制的深入了解。缺氧是类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）关节滑膜微环境的重要特征之一,在滑膜增生中起重要作用。在细胞存活方面,成纤维细胞样滑膜细胞（Fibroblast-like synovial cells,FLSs）相对受到缺氧的影响。相比之下,类风湿性关节炎患者的成纤维细胞样滑膜细胞（Fibroblast-like cells from patients with rheumatoid arthritis,RA-FLSs）对缺氧诱导的细胞死亡具有特别的抵抗力。在缺氧调控线粒体自噬的机制研究中发现,作为线粒体外膜蛋白,Bcl-2与腺病毒E1B 19 k Da相互作用蛋白3（Bcl-2 and adenovirus E1B 19 k Da-interacting protein 3,BNIP3）通过与自噬膜蛋白微管相关蛋白1A/1B-轻链3（Autophagy membrane protein microtubule associated protein 1A/1B light chain 3,LC3）结合介导自噬隔离膜对线粒体的识别。此外,BNIP3受缺氧调控,也是缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的关键靶基因之一。已有研究揭示了缺氧下BNIP3被转录上调进而激活线粒体自噬的分子机制。BNIP3对线粒体自噬调控除了受转录水平的影响之外,目前对其翻译后修饰调控线粒体自噬的机制所知甚少。RA-FLSs在关节滑膜缺氧微环境中表现出异常增殖以及凋亡不足的特点。研究表明线粒体自噬参与了细胞缺氧下的适应性反应。以往的研究表明,栀子苷（Geniposide,GE）可通过下调过度激活的JNK信号通路抑制RA-FLSs的异常增殖以发挥其抗炎作用,但GE对缺氧下RA-FLSs线粒体自噬的影响尚不清楚。1目的本研究旨在探讨BNIP3对线粒体自噬的调控作用在OA-FLSs/RA-FLSs对缺氧的适应性反应中的作用,揭示缺氧通过磷酸-蛋白酶体降解途径和泛素化修饰调控BNIP3的表达,及其翻译后修饰对线粒体自噬的具体调节作用及其上游调控机制,阐明GE对RA-FLSs线粒体自噬的干预作用。2方法分别采用HE染色,免疫组织化学及Western blot检测AA大鼠关节滑膜中自噬及凋亡的变化情况,采用CCK-8、流式细胞术和Brd U检测细胞增殖情况,用AV/PI、TUNEL和Western blot检测细胞凋亡,用电镜、荧光共定位和Western blot观察线粒体自噬功能,ROS和JC-1检测线粒体状态,用Western blot和RT-q PCR检测BNIP3和HIF-1α。BNIP3的沉默是通过si RNA技术实现的。通过放线菌酮（Cycloheximide,CHX）及TNF-α处理RA-FLSs观察BNIP3是否是Caspase切割的产物,通过蛋白酶体抑制剂MG-132（1μM）及CHX（5μg/m L）处理RA-FLSs检测BNIP3表达量变化以确认缺氧下其能否被泛素化修饰及其降解速度。体外Lambda蛋白磷酸酶实验验证磷酸化修饰是否导致了BNIP3条带的转变。通过磷酸酶抑制剂（Okadaic Acid,OA,0-100 n M）处理RA-FLSs观察21%及2%O2下BNIP3表达量变化情况确认磷酸化修饰是否参与BNIP3的调节。进一步通过构建S66/T72A阻断磷酸化和模拟磷酸化的S66D或S66E点突变以确认S66/T72是BNIP3磷酸化修饰的主要位点。通过JNK抑制剂及激活剂观察BNIP3的表达变化,进一步通过si RNA敲低JNK激酶观察其对BNIP3磷酸化水平及线粒体自噬发生量的影响,免疫共沉淀法检测p-JNK与BNIP3的相互作用。3结果1.缺氧下线粒体自噬的变化及BNIP3介导线粒体自噬对细胞存活调节作用随着造模时间的延长,AA大鼠关节滑膜中凋亡逐渐被抑制,自噬不断增加,该过程伴随着缺氧程度的加剧。经3-MA（15 mg/kg）抑制自噬后,AA大鼠滑膜中凋亡增加,关节滑膜缺氧程度得以改善,缓解滑膜增生。经2%O2处理24 h后RA-FLSs存活能力明显增加ROS积累量未发生明显变化,线粒体膜电位保持恒定,凋亡率较低,而线粒体自噬发生量显著增加。而0.5%O2处理24 h明显抑制RA-FLSs的存活,ROS积累量增加,诱导大量RA-FLSs线粒体膜电位的降低,凋亡率升高,线粒体自噬略有上升。21%O2下,经过3-MA（3 m M）处理抑制线粒体自噬的发生后,RA-FLSs中ROS的积累量及线粒体膜电位未发生明显改变,凋亡率无明显增加。而2%及0.5%O2下,经3-MA处理后RA-FLSs中ROS积累量明显增多,线粒体膜电位降低,诱导RA-FLSs凋亡的大量发生。此外,缺氧后,OA-FLSs的存活率降低,RA-FLSs的增殖活性进一步增强。缺氧诱导OA-FLSs凋亡增加,抑制线粒体自噬,但不诱导RA-FLSs凋亡的发生。缺氧导致RA-FLSs更持久的适应性反应。RA-FLSs在HIF-1α转录调控的基因表达中表现出更显著的增加。有趣的是,RA-FLSs比OA-FLSs表现出更高的BNIP3表达,并且表现出更强的线粒体自噬和增殖活性。在RA-FLSs中的BNIP3 si RNA实验证实了BNIP3在RA-FLSs存活中的潜在作用。BNIP3的抑制导致细胞增殖、线粒体自噬的抑制和凋亡的增加。2.缺氧下泛素-蛋白酶降解及磷酸化对BNIP3表达的调控及其介导的线粒体自噬的变化CHX（5μg/m L）处理,RA-FLSs中BNIP3的表达量显著降低,其半衰期约为6 h,无论常氧或缺氧下,MG-132（1μM）均可促进BNIP3的积累,提示BNIP3能经泛素-蛋白酶体途径被快速降解。经λ-PP处理后,不同氧浓度下BNIP3的多条条带均下移到21.5 k Da位置,OA在0-100 n M范围内以剂量依赖性地促使BNIP3条带自21.5 k Da上移至30 k Da,证实磷酸化修饰是导致BNIP3出现多条带的原因。通过OA（100 n M）联合CHX（5μg/m L）和MG-132（1μM）处理发现磷酸化明显减缓BNIP3的降解速度,其稳定性的维持与磷酸化修饰息息相关。通过构建S66/T72A阻断BNIP3磷酸化和模拟磷酸化的S66D或S66E点突变发现S66的磷酸化能增强BNIP3的蛋白稳定性并增强其介导的线粒体自噬发生量。敲低JNK不仅诱导BNIP3磷酸化水平的降低,同时还诱导了BNIP3蛋白表达量的明显减少,JNK通过磷酸化BNIP3的S66位点参与其泛素化修饰及蛋白酶体的降解途径的调控。3.GE对线粒体自噬的干预作用及其机制GE（60 mg/kg）导致AA大鼠滑膜异常增生,导致LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Bcl-XL、HIF-1α、BNIP3的表达降低,并增加Bax的表达。GE（100μM）抑制缺氧下RA-FLSs的异常增殖,下调线粒体自噬发生量,导致ROS的大量积累和线粒体膜电位降低,诱导细胞凋亡,并下调JNK-BNIP3通路过度激活。4结论1.2%O2下,RA-FLSs诱导线粒体自噬发生量的增加以抑制凋亡的发生,诱导细胞的增殖。而0.5%O2下,RA-FLSs中的线粒体自噬发生量虽有所增加,但凋亡量增多以致细胞存活率降低。而RA-FLSs通过线粒体自噬发生量的增加以维持细胞内氧化还原平衡,促进细胞缺氧存活。OA-FLSs的线粒体自噬量较小,无法维持线粒体的氧化还原平衡,导致细胞凋亡的发生。缺氧下OA-FLSs和RA-FLSs之间线粒体自噬能力的差异是由BNIP3表达的高低所介导的。2.缺氧下,JNK参与了RA-FLSs中BNIP3的泛素化-蛋白酶体降解和磷酸化修饰途径的调节,最终增加线粒体自噬发生量以发挥促细胞存活的新机制,即缺氧通过激活JNK磷酸化BNIP3的S66位点,继而增强BNIP3的稳定性,增加线粒体自噬的发生量促进细胞存活。3.GE下调过度激活的JNK-BNIP3信号通路,抑制线粒体自噬的发生,导致ROS积累、线粒体膜电位的下降,以诱导RA-FLSs凋亡增加,抑制缺氧下RA-FLSs过度增殖以发挥治疗RA的作用,可能与下调JNK表达后抑制BNIP3的磷酸化修饰,诱导BNIP3发生泛素-蛋白酶体降解有关。