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杜仲为我国特有的名贵药材,药用历史悠久,始载于《神农本草经》,列为上品,来源于杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oilv.)的干燥树皮,具有补肝肾、强筋骨、安胎之功效,用于肝肾不足,腰膝酸痛,筋骨无力,头晕目眩,妊娠漏血,胎动不安等症。然而,产地、采收、加工、“发汗”方法等因素对杜仲药材有效成分及其品质形成产生一定的影响,导致商品药材质量参差不齐。如何在药材生产过程中,保证杜仲药材的优质和质量均一已成为其生产过程中的关键问题。本课题通过对杜仲药材中多元指标成分的系统分析,比较不同产地、不同生长年限和采收时间、不同加工方法和“发汗”条件杜仲中各指标成分的变化;采用超快速液相色谱-串联四极杆飞行时间高分辨质谱(UFLC-Triple TOF-MS/MS)技术对杜仲进行植物代谢组学研究,分析比较不同产地、不同生长年限、不同采收时间、不同加工方法及不同“发汗”条件杜仲药材以及杜仲不同药用部位、化学成分及其差异,筛选、鉴定差异化学成分,并找出其量的变化规律;采用荧光原位杂交技术(FISH)对杜仲“发汗”过程中不同阶段的样品进行测定,分析比较杜仲“发汗”过程中不同阶段微生物群落结构变化;结合菌种分离纯化技术得到杜仲中内生菌种,并采用UFLC-Triple TOF-MS/MS对不同菌种接种杜仲及“发汗”杜仲与灭菌后烘干杜仲化学成分的差异性进行分析。课题研究内容主要包括以下几个方面:1、文献研究系统查阅杜仲国内外相关文献,对其进行文献综述研究。2、杜仲化学成分分析采用UFLC-Triple TOF MS/MS技术对杜仲中化学成分进行分析,根据高分辨质谱获得的化合物精确分子量、碎片离子峰、色谱保留时间及对照品信息,结合参考相关文献数据,初步鉴定出木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类和黄酮类35种成分,并推测其可能的裂解途径及规律,为进一步探究杜仲药材的功效物质基础、质量变化规律及质量调控机制提供基础资料。3、杜仲不同产地及商品药材质量分析建立超快速液相-串联三重四级杆线性离子阱质谱(UFLC-QTRAP-MS/MS)同时测定杜仲不同产地及商品药材中木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类和黄酮类14种指标成分含量的方法,对不同产地及商品药材进行比较分析。用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)同时测定不同产地杜仲药材中24种无机元素含量。用UFLC-Triple-TOF-MS/MS技术分析不同产地杜仲中化学成分的差异性,并通过多元统计分析找出差异显著的化学成分及其变化规律。结果表明:杜仲不同产地及商品药材中14种指标成分存在明显差异;不同产地杜仲中无机元素含量存在明显差异;主成分分析(PCA)表明不同产地杜仲中化学成分存在明显差异,通过偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)找出14种共有差异化学成分。4、杜仲次生代谢产物的动态积累及变化规律研究用UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定不同生长年限及采收时间杜仲中14种成分的含量。用ICP-OES同时测定不同生长年限及采收时间杜仲中24种无机元素含量。用UFLC-Triple-TOF-MS/MS技术分析不同生长年限及采收时间杜仲中化学成分的差异性。结果表明:不同生长年限及采收时间杜仲中14种指标成分存在明显差异,灰色关联度分析显示7～10年生、六月初采收杜仲质量较优;无机元素在不同生长年限及不同采收时间杜仲中呈现动态变化;不同生长年限和不同采收时间杜仲中化学成分存在明显差异,通过进一步PLS-DA分析,分别找出18种和12种差异化学成分。5、产地加工方法及“发汗”条件对杜仲药材化学成分的影响研究 用UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定不同加工方法及“发汗”条件杜仲中14种成分的含量。用UFLC-Triple-TOF-MS/MS技术分析不同加工方法及“发汗”条件杜仲中化学成分的差异性。结果表明:不同加工方法及“发汗”条件杜仲中14种指标成分含量存在明显差异,灰色关联度分析表明产地“发汗”以及“去粗皮直接堆置发汗”质量较优;不同加工方法杜仲由PCA分析可大致分为两组,找出9种差异显著的化学成分;不同“发汗”条件杜仲由PCA分析可大致分为两组,找出10种差异显著的化学成分。6、杜仲“发汗”过程中微生物群落结构分析及其对化学转化的影响本实验采用荧光原位杂交技术(FISH)对杜仲“发汗”过程中不同阶段的样品进行测定,分析比较杜仲“发汗”过程中不同阶段微生物群落结构变化。结合菌种分离纯化技术得到杜仲中内生菌种,并用UFLC-TripleTOF-MS/MS结合多元统计分析技术对不同菌种接种杜仲及“发汗”杜仲与灭菌后烘干杜仲化学成分的差异性进行分析。通过二级串联质谱分析,对其质谱数据进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理等进行特征峰提取;运用SPSS进行聚类分析,运用SIMCA-P13.0对数据进行PCA分析。结果表明:杜仲“发汗”不同阶段微生物群落结构具有明显的变化;杜仲接种内生菌模拟“发汗”与灭菌后烘干杜仲和“发汗”杜仲中化学成分存在明显差异。7、杜仲不同药用部位化学成分的比较分析采用UFLC-Triple TOF MS/MS技术对杜仲雄花中化学成分进行分析。用UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定杜仲、杜仲叶和杜仲雄花中21种指标成分的含量。用ICP-OES同时测定杜仲、杜仲叶和杜仲雄花中24种无机元素含量。用UFLC-Triple-TOF-MS/MS技术分析杜仲、杜仲叶和杜仲雄花中化学成分的差异性。结果表明:分析鉴定出杜仲雄花中32种化学成分并推测其裂解途径;杜仲不同药用部位中化学成分存在明显差异,找出其中23种共有差异成分及其变化规律。