【摘 要】
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食物过敏是全世界关注的重要食品安全问题。现阶段,由于有效的食物过敏治疗手段相对匮乏,患者仅可通过避免摄入致敏原以防止食物过敏的发生。目前,致敏原检测方法主要分为基于蛋白水平的免疫学检测和基于基因水平的分子生物学检测,但这两类方法均存在前处理繁琐复杂的局限性,无法满足现场快速检测致敏原的需求,因此亟待建立一种快速、准确、高灵敏的致敏原检测方法。微针阵列（Microneedle,MN）贴片法以其快速提
【基金项目】
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浙江省自然科学基金探索项目《基于蛋白质仿生捕获技术的婴幼儿配方食品致敏原快速精准识别机制研究（LY21C200008）》； “十三五”国家重点研发计划项目“食物过敏标识的风险评估技术研究”（项目编号:2019YFC1605000）之课题四“基于特征肽段同位素稀释质谱法的食物致敏原确证关键技术研究”（课题编号:2019YFC1605004）；
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食物过敏是全世界关注的重要食品安全问题。现阶段,由于有效的食物过敏治疗手段相对匮乏,患者仅可通过避免摄入致敏原以防止食物过敏的发生。目前,致敏原检测方法主要分为基于蛋白水平的免疫学检测和基于基因水平的分子生物学检测,但这两类方法均存在前处理繁琐复杂的局限性,无法满足现场快速检测致敏原的需求,因此亟待建立一种快速、准确、高灵敏的致敏原检测方法。微针阵列（Microneedle,MN）贴片法以其快速提取目标物的独特优势被视为一种极具发展潜力的前处理方法;金属有机框架（Metal organic framework,MOF）作为一种新型纳米酶,被证明具有优异的类过氧化物酶活性,在检测信号放大领域拥有巨大的应用前景。鉴于此,本论文拟以牛奶致敏原β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-Lg）为模型致敏原,以负载核酸适配体的MN贴片为致敏原快速捕获元件,以负载适配体互补序列（Reverse complement,RC）的MOF为信号放大元件,进一步将二者结合构建基于特异性微针阵列贴片-MOF纳米酶的致敏原快速可视化检测系统,为开发新型致敏原现场快速检测技术提供借鉴与参考。主要研究内容与结果如下:1、MN贴片对于不同质地食品的穿刺规律研究。采用由不同浓度针体制作液制备的MN贴片,以质地各异的食品原材料（生、熟三文鱼,生、熟鸡肉,生、熟猪肉,生、熟牛肉）和加工食品（布丁、奶酪、火腿肠、鱼豆腐）为研究对象,在研究MN贴片的压缩性能、穿刺性能和溶胀性能的基础上,探索不同浓度MN贴片对不同质地食品的穿刺规律。研究结果表明,MN贴片穿刺所有模型食品所应具备的最低承受压力为0.36 N/根微针。上述研究为设计适用于致敏原快速灵敏检测系统的MN贴片提供理论依据。2、致敏原快速捕获元件及信号放大元件的构建。采用适配体与MN贴片共价结合构建致敏原快速捕获元件,RC与MOF共价结合构建信号放大元件,并对两类元件优化。研究结果表明,在优化的制备条件下,致敏原快速捕获元件最大能够承受压力为1.22 N/根微针,且具有较好的穿刺性能,浸泡10 min后溶胀率达138.94±5.11%,且浸泡30 min后针形依旧完整,具有较好的亲水及耐水性能;通过相关优化得到的信号放大元件中RC投料量为0.5μmol/纳米酶（g）,且其具有3.76倍的信号放大能力。上述研究为构建快速灵敏的致敏原可视化检测系统提供了良好的物质基础。3、基于特异性微针阵列贴片-MOF纳米酶的致敏原快速检测系统的建立。以牛奶β-乳球蛋白（β-Lg）为致敏原代表,将致敏原快速捕获元件及信号放大元件结合,构建基于特异性微针阵列贴片-MOF纳米酶的致敏原快速检测系统,并对检测条件进行靶向优化。在优化的检测条件下,MN-MOF检测系统前处理环节仅需3 min,整体检测时间仅为45 min,检测信号与致敏蛋白浓度在1～1000μg/mL范围内呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-0.128x+0.641（R~2=0.995）,检出限为0.34μg/mL（S/N=3）,定量限为6.97μg/mL（S/N=10）,同时该方法具有良好的特异性、准确度及精密度。以市售样品为研究对象时,检测结果与商业化ELISA试剂盒测试结果相当,证明其具有较高的应用潜力。综上所述,本研究建立的MN-MOF检测系统耗时短、灵敏度高、特异性好,且具有良好的准确度,极具应用前景,可为食物致敏原的现场快速筛查提供全新途径。
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