论文部分内容阅读
研究背景TNF-α是一种具有复杂生物活性的细胞因子，它主要由巨噬细胞和T细胞产生。该物质除了能够在体内或体外杀伤肿瘤细胞外，还具有抗病毒感染、激活巨噬细胞及多形核粒细胞、促进组织相容性抗原表达、调节机体免疫机能等多种功能。但是，当肿瘤坏死因子过量表达时，它与其它炎症因子一起产生多种病理损伤，如：自身免疫性疾病，感染性疾病，恶液质等。因此，中和体内过量的TNF—α，可为上述疾病的治疗提供一条有效途径。目前，临床上通过中和体内过量的TNF—α，治疗上述疾病的药物有：TNF—α单克隆抗体和TNF—α可溶性受体。但是，这些药物存在有用药量大、需长期反复使用、易引起超敏反应的缺陷。疫苗只需少量注射就可以诱发产生抗体，可克服抗体及可溶性受体药物的缺陷。因此TNF—α疫苗是治疗此类疾病的一条有效途径。目的 观察表面呈现人TNF-α的丝状噬菌体颗粒和人TNF-α与GST融合蛋白在小鼠体内的免疫作用，为人TNF-α自体疫苗的研制奠定基础。 第四军医大学硕士学位论文方法用噬菌体表面呈现技术，将人TNF一克隆入pCANTABSE噬菌粒载体，使TNF一a呈现于噬菌体cpm的N末端，得到表面呈现人TNF一Q的重组噬菌体颗粒。将人TNF一Q克隆入pGEx一4T一融合表达载体，重组质粒转化大肠杆菌DH5a，经IPTG诱导表达，亲合色谱法纯化，得到GST一TNF融合蛋白。用这两种蛋白颗粒对小鼠进行免疫，观察免疫效果。结果TNF一Q重组噬菌体的酶联免疫吸附实验，点杂交实验和竞争抑制试验结果均表明TNF一a呈现于噬菌体cplll的N末端，TNF一a重组噬菌体颗粒具有TNF一a的免疫反应性。表面呈现TNF一的噬菌体颗粒对L929细胞的杀伤活性试验结果表明，表面呈现TNF一a的噬菌体颗粒不具有人TNF一a的细胞杀伤活性。GST一TNF融合蛋白的Western blot实验结果表明TNF一与GST融合表达，经亲合柱纯化，获得纯度约90.4%的融合蛋白，L929细胞杀伤活性试验结果证明GST一TNF融合蛋白具有人TNF一Q的L929细胞杀伤活性，作为疫苗需作灭活处理。用TNF一Q重组噬菌体颗粒和GST一TNF融合蛋白免疫小鼠，结果表明TNF一Q重组噬菌体颗粒和GST一TNF融合蛋白均可在小鼠体内诱发特异的鼠抗人TNF一a抗体。结论制备了表面呈现人TNF一a的噬菌体颗粒和GST一TNF融合蛋白。表面呈现人TNF一a的噬菌体颗粒不具有人TNF一Q的L929细胞杀伤活性，可直接进行免疫。GST一TNF融合蛋白具有L929细胞杀伤活性，作为疫苗成份需进行灭活处理。噬菌体和GsT均可作为疫苗载体，在动物体内诱发特异的免疫反应。其中，GST一TNF融合蛋白免疫诱发的抗体滴度较高，TNF一Q重组噬菌体颗粒免疫诱发的抗体滴度较低。分析原因可能是因为TNF一a在M13呈现系统中呈现率较低，改用其他第四军医大学硕士学位论文的噬菌体呈现系统有望在小鼠体内诱发高滴度的鼠抗人TNF一Q抗体。以上研究为研制TNF一a自体疫苗奠定了基础。