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第一部分：黄芩素联合As2O3对人肝癌细胞促凋亡作用的研究目的：通过检测黄芩素联合As2O3对肝癌细胞的增殖能力,凋亡及凋亡相关蛋白、PI3K、 AKT表达情况的影响,初步探讨黄芩素是否增强As2O3对肝癌细胞的促凋亡作用及其可能作用机制。方法：1.本研究以人高转移潜能肝癌细胞株LM9、人低转移潜能肝癌细胞株MHCC97L为研究对象,利用MTT方法检测不同作用浓度及作用时间的黄芩素、As2O3单用和联用对肝癌细胞株的增殖抑制率,并根据q值判断两药联用的性质,筛选出后续实验的药物作用时间和浓度。2.黄芩素、As2O3单用和联用分别处理LM9和MHCC97L细胞株后,行PI染色后用流式细胞仪检测肝癌细胞的周期分布；通过Tunel技术原位检测肝癌细胞的凋亡情况。3.采用Real-Time PCR和Western blot方法,检测上述药物干预后肝癌细胞凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-9的mRNA和蛋白质水平的表达情况；运用Western blot方法检测PI3K、AKT和P-AKT的蛋白表达。结果：黄芩素、As2O3单药及联合后均能明显抑制LM9和MHCC97L细胞增殖能力,两药联合作用更强,并呈明显时间和剂量依赖性效应；计算联合用药q值,提示联合用药表现为协同效应。黄芩素、As2O3单用及联合均能够明显导致肝癌细胞G0/G1期停滞和细胞凋亡率升高,两药联合作用强于单药。药物处理后肝癌细胞的caspase-3、caspase-6及caspase-9的mRNA和蛋白水平表达显著升高而PI3K、p-AKT蛋白表达下降,且联合组作用更明显。结论：黄芩素增强As2O3对肝癌细胞的促凋亡的作用,同时引起PI3K、p-AKT表达的下调及caspase-3、caspase-6及caspase-9的上调；推测黄芩素可能是通过抑制PI3K/AKT通路增强As2O3对肝癌细胞促凋亡的作用。第二部分黄芩素促As2O3诱导人肝癌细胞凋亡作用机制的探索性研究目的：本研究通过DNA重组技术对MHCC97L肝癌细胞株的AKT表达进行干扰和过表达,检测黄芩素、As2O3单用及联合用药处理后肝癌细胞周期分布及凋亡率变化、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bad以及凋亡有关蛋白caspase-3、caspase-9的表达情况,同时检测AKT及下游信号通路的激活水平,以期获得黄芩素提高As2O3抑制AKT信号通路的证据,进一步探讨两药联合用药促进凋亡的具体机制。方法：1.利用DNA重组技术构建AKT特异性的shRNA;构建成功后,转染MHCC97L细胞,通过Real-Time PCR及Western Blot检测AKT-shRNA的干扰效果,筛选干扰效果最佳的靶点进行后续实验。2.构建AKT-shRNA肝癌细胞模型,经黄芩素、As2O3及联合用药处理,分别经PI单染和Annexin V/PI双染后,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的变化；Western Blot检测Bad、Bcl-2及caspase-3、caspase-9蛋白的表达变化；同时利用Western Blot检测AKT、 p-AKT及下游GSK3β、S6K、mTOR、4EBP1蛋白及磷酸化水平的变化情况。3.构建AKT过表达肝癌细胞模型,经黄芩素、As2O3及联合用药处理,通过流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化；Western Blot检测Bad、Bcl-2及caspase-3、caspase-9蛋白的表达变化；同时利用Western Blot检测AKT、pAKT及下游GSK3β、S6K、 mTOR、EBP1蛋白及磷酸化水平的变化情况。结果：1.成功构建AKT-shRNA表达载体,mRNA及蛋白水平检测发现其干扰效率最高可达到80%以上,满足后续实验需求。2.用shRNA抑制AKT后,肝癌细胞出现G0/G1期停滞和凋亡比率增加,AKT-shRNA可模拟黄芩素、As2O3对细胞的抑制作用；黄芩素、As2O3单用时促凋亡作用均加强,且两者联用时抑制效果更明显。说明抑制AKT信号通路可诱导肝癌细胞凋亡。黄芩素及As2O3能够提高AKT-shRNA的诱导凋亡作用,同时黄芩素能够进一步促进As2O3的抑制作用,从而导致凋亡增加。3.用shRNA抑制AKT后,肝癌细胞的促凋亡蛋白Bad的表达增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降、凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9蛋白表达水平增加,AKT-shRNA可模拟黄芩素、As2O3对细胞caspase-3、caspase-9上调作用；同时黄芩素、As2O3单用时以上作用均加强,两者联用时作用更明显。说明黄芩素及As2O3均能加强AKT-shRNA对以上蛋白表达的影响,并且黄芩素能够进一步上调As2O3的作用,从而促进肝癌细胞的凋亡。4.用shRNA抑制AKT后,肝癌细胞的AKT、p-AKT、p-GSK3p、p-S6K、mTOR、p-4EBP1蛋白的表达下降；同时黄芩素、As2O3单用时对以上蛋白下调作用均加强,且两者联用时下调作用更明显,说明黄芩素及As2O3均能加强AKT-shRNA对以上蛋白的抑制作用,黄芩素能够进一步加强As2O3对AKT及下游蛋白的抑制作用,从而使以上蛋白的表达进一步下调。5.AKT过表达后,肝癌细胞的凋亡显著降低；黄芩素、As2O3及联合药物干预肝癌细胞,均表现诱导细胞凋亡的效应降低,部分回复As2O3及黄芩素引起的肝癌细胞凋亡作用。过表达能够显著降低黄芩素、As2O3及联合处理对凋亡蛋白Bad及caspase-3、 caspase-9蛋白的上调作用和抗凋亡蛋白Bcl-2下调作用。同时AKT过表达能够抑制黄芩素及As2O3对p-AKT及下游蛋白p-GSK3β、mTOR、p-S6K、p-4EBP1的抑制作用。结论：1.AKT信号通路与肝癌细胞的凋亡和增殖相关,抑制AKT蛋白均能显著影响肝癌细胞的增殖和凋亡,AKT成为潜在的治疗肝癌的药物新靶点。2.As2O3通过抑制AKT及下游通路蛋白的激活从而诱导肝癌细胞凋亡；黄芩素能够上调As2O3对AKT通路的抑制作用,促进肝癌细胞的凋亡增加。3.三氧化二砷和黄芩素联合可能成为潜在治疗原发性肝癌的有效方法。第三部分黄连解毒汤和三氧化二砷冻干粉针联合应用治疗中晚期原发性肝癌的疗效和安全性的分析目的：评价黄连解毒汤和三氧化二砷冻干粉针与单纯应用三氧化二砷冻干粉针在治疗不能手术的中晚期原发性肝癌的客观疗效和不良反应的差异。方法：本研究收集了2008-2015年度13例应用三氧化二砷联合黄连解毒汤的PHC患者,设立为病例组,21例单纯应用三氧化二砷的PHC患者,设立为对照组,并对其治疗前后的统计学资料进行分析。给药方法：患者口服黄连解毒汤为主的中草药方剂,同时给予三氧化二砷注射粉剂10mg溶于0.9%氯化钠针500m1中静脉滴注4h,每天1次,每周用药5天,停2天,共用药治疗28天为1个周期。治疗中每周复查血常规、肝肾功能、肿瘤标志物、腹部CT。间隔14天始下个周期,每位患者至少接受2个周期以上治疗。从患者的客观疗效、KPS评分、不良反应方面,评价黄连解毒汤和As2O3联合运用治疗中晚期PHC疗效和安全性的差异。统计学上应用SPSS21.0统计学软件进行统计学分析。两组数值变量资料比较采用两独立样本t检验,多组数值变量资料分布未知,比较采用秩和检验。各种率的比较采用卡方检验,因样本例数<40例,需同时进行Fisher精确检验校正。结果：统计学分析患者性别、发病平均年龄、用药前疾病分期、可能病因、用药前发病时长的构成比,两组患者治疗前在人口统计学水平和疾病进展程度上无显著统计学差异,具有较好的同质性。治疗后病例组和对照组,均无完全缓解的患者,15.4%和7.8%患者肿块大小缩小大于50%,达到部分缓解,53.8%和66.7%患者肿块缩小小于50%,达到疾病稳定,30.8%和28.6%患者肿块增大疾病进展,治疗效果无统计学差异；38.%和28.6%患者用药后肝区疼痛逐步缓解、腹水量下降并肝功能有所好转,生活质量改善,患者KPS评分有所改善,两组KPS评分改善比率有统计学差异,但53.8%和47.6%患者KPS评分保持稳定,两组KPS评分稳定比率相比无统计学差异,两组总KPS评分变化无明显统计学差异。两组患者不良反应主要为轻微腹胀、双下肢水肿、便秘、白细胞下降,病例组和对照组未发生毒性反应的比例为61.5%和33.3%,Ⅰ度毒性反应发生率为15.4%和28.6%,Ⅱ度毒性反应发生率为23.1%和33.3%,唯一1例发生Ⅲ度毒性反应,即为对照组的白细胞下降,无统计学差异。结论：黄连解毒汤和三氧化二砷冻干粉针治疗不能手术的中晚期原发性肝癌有一定的疗效并不良反应可控,和单纯应用三氧化二砷针剂相比,KPS评分改善比率有统计学差异,缓解率和不良反应发生率无统计学差异。