马尔尼菲青霉真菌(Penicillium marneffei PM)是青霉真菌属中唯一的一种温度依赖性的双相型条件致病真菌,它是马尔尼菲青霉真菌病(Penicilliosis marneffei PSM)的病原菌,25℃时以菌丝相生长,在37℃体外培养或者感染人体后转换为致病性酵母相生长;主要流行区域在东南亚地区,PM对免疫功能低下的患者感染性强,对感染者造成致命性的全身性感染。目前,马尔尼菲青霉真菌双相转换和致病性的分子机制尚不清楚。细胞转录因子是细胞感受外界信号后调控基因表达的关键分子,许多转录因子在调控基因表达的同时其基因自身的表达会受到调控。深入研究转录因子及其调控基因功能探讨马尔尼菲青霉双相转换与致病性分子机制,可为马尔尼菲青霉病防治和药物开发提供科学依据[1-6]。目的:1、本课题组前期进行的马尔尼菲青霉菌链特异性转录组的测序分析发现,编码含亮氨酸拉链(bZIP)的转录因子基因Atf21和编码含有同源异型盒(homeobox)结构域的转录因子基因Phx1在双相转换过程中差异表达显著,本课题通过构建马尔尼菲青霉菌Atf21和Phx1基因缺失突变体,对转录因子基因Atf21和Phx1的功能进行了初步研究,探讨马尔尼菲青霉双相转换与致病性分子机制,可为马尔尼菲青霉病防治和药物开发提供科学依据。2、本课题组前期研究发现编码角质酶转录因子β亚基基因(Ctf1β)及其调控的角质酶基因在酵母相表达显著升高。本课题拟通过克隆马尔尼菲青霉菌角质酶的基因,构建角质酶原核表达重组菌,进行角质酶的活性鉴定与分析,获得重组蛋白为进一步制备马尔尼菲青霉菌角质酶抗体和探讨该抗体在防治马尔尼菲青霉病中的应用奠定基础。方法:1、用实时荧光定量方法分析马尔尼菲青霉菌株gxff在双相转换过程中基因表达量和基因表达特征。2、利用同源重组方法,构建目的基因敲除突变株,然后与spm4野生菌株进行对比研究,初步研究和分析突变缺失基因的功能。3、通过引物设计、pcr扩增马尔尼菲青霉菌角质酶基因序列,构建诱导型表达载体,并对重组质粒进行pcr鉴定和质粒的测序;用碱式滴定法测定酶活性;提取蛋白对角质酶进行表达鉴定。结果:1、atf21和phx1基因在马尔尼菲青霉菌双相转换不同时相的表达进行分析结果表明,在马尔尼菲青霉菌株gxff中atf21和phx1基因表达在菌丝相生长状态显著高于在酵母相生长状态,与在马尔尼菲青霉菌株frr2161中转录组测序分析atf21基因表达结果一致;atf21在双相转换早期基因表达明显改变,在双向转化过程中phx1基因表达出现明显改变时间较晚。2、成功构建了atf21和phx1基因敲除菌株,与对照菌spm4对比,atf21突变菌株对cu更加敏感,phx1突变菌株对cu的敏感性无影响。3、成功克隆了马尔尼菲青霉菌角质酶基因,构建了诱导型表达载体并进行测序验证;构建了马尔尼菲青霉菌角质酶基因大肠杆菌原核表达重组菌株;用碱式滴定法测定重组菌株酶活性约为对照菌1.7倍,粗酶液的酶活性可达21.8u/ml。结论:1、马尔尼菲青霉菌atf21和phx1基因在双相转换不同时相表达差异显著,atf21和phx1基因表达在菌丝相生长状态显著高于在酵母相生长状态;atf21在双相转换早期基因表达明显改变,在双向转化过程中phx1基因表达出现明显改变时间较晚。2、成功构建了atf21和phx1基因敲除菌株,创新性地发现马尔尼菲青霉菌转录因子基因atf21具有调控铜离子代谢功能,为深入探讨马尔尼菲青霉双相转换与致病性分子机制奠定了基础。3、成功克隆了马尔尼菲青霉菌角质酶基因,构建了马尔尼菲青霉菌角质酶基因大肠杆菌原核表达重组菌株,为进一步获得重组蛋白制备马尔尼菲青霉菌角质酶抗体和探讨该抗体在防治马尔尼菲青霉病中的应用奠定基础。