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新城疫与禽流感并列为世界公认的最重要的两大禽类疫病,二者为OIE规定的动物必报疾病。新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种急性烈性高度接触性传染病,可经呼吸道,消化道,眼结膜等多种途径传播,致死率极高。流行病学调查显示,国内近年来新城病毒流行毒株以基因VII型为主。H9N2亚型禽流感（Avian influenza,AI）是由H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的一种接触性传染病,传播途径与NDV相同。H9N2 AIV属于中低等毒力毒株,大部分情况不致死,但会引起动物生产性能的严重下降,给养禽业造成了巨大的经济损失,且因A型流感病毒基因的抗原漂移与抗原转换,AIV对公共卫生安全造成了极大地威胁。在临床案例中NDV经常与H9N2 AIV伴随感染,因而对ND和H9N2亚型禽流感的联合防控十分必要。黏膜组织是动物机体最大的防御屏障,是抵御病原入侵的第一道防线。95%以上的病原入侵发生在黏膜组织。研究数据表明鼻腔免疫不仅可以诱发良好的局部免疫保护,还可以诱导产生全身体液免疫反应。在众多黏膜免疫细胞中,树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作为一种专职免疫细胞其抗原递呈能力最强,树突状细胞参与决定免疫应答的性质,强度以及免疫记忆性。树突状细胞诱导肽（Dendritic cell-targeting peptide,DCpep）是由12个氨基酸组成的短链肽,可以特异性靶向DCs,有利于DCs对抗原的识别捕获,从而诱发高效的黏膜免疫反应,进而主导和调节黏膜免疫。已有研究证明,重组丙型肝炎病毒抗原融合DCpep（树突状细胞靶向肽）后再作用于DCs,可诱发机体产生强烈的免疫反应,并且发现抗原融合DCpep没有修改DCs的表型和功能,而是介导DCs靶向识别抗原刺激抗原成熟,起到生物佐剂作用。病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）是一种高度结构化的空心蛋白颗粒,并且不含病毒基因组,因而病毒样颗粒具有良好的免疫原性且无散播病毒基因的风险,HN蛋白是NDV的主要免疫保护性抗原,由其诱导小鼠产生的特异性抗体足以保护小鼠免受NDV强毒威胁。HA蛋白是H9N2亚型AIV的主要免疫保护性抗原,可诱发机体产生中和抗体,这种抗体可以在感染以及发病过程中起到强有力的抵抗作用。Fan等研究表明,重组杆状病毒表达的AIV HA能够诱导小鼠产生强烈的免疫反应,可完全保护小鼠免受H9N2病毒感染[1]。针对以上问题,本实验构建了两种可一针两防,与流行毒株相匹配的,无基因污染风险,可引起强烈免疫应答的新型新城疫-禽流感二联苗,NDV-AIV病毒样颗粒:（1）将NDV的F蛋白胞外域替换成H9N2亚型禽流感病毒HA的胞外域,命名为FcHA;（2）将DCpep基因与H9N2病毒基因的HA胞外域N端融合,将融合之后的基因替换NDV F蛋白的胞外域,命名为DCpep-FcHA。将二者分别与HN共表达在M蛋白构成的ND VLPs表面。分别命名为VLP-HA/HN和DCpep-VLP-HA/HN。将病毒样颗粒纯化后,经不同方式给SPF鸡免疫,通过比较两种病毒样颗粒以及灭活的新城疫-H9N2型禽流感二联苗的免疫原性。结合免疫方式,免疫路径,评价出优势病毒样颗粒侯选苗,为防控新城疫和禽流感提供新的策略。1、重组杆状病毒rBV-HA和rBV-DCpep-HA的构建与鉴定。首先设计引物对目的基因F胞内域跨膜域、HA基因胞外域进行扩增并引入酶切位点,通过overlapPCR将两者连接,构建FcHA。DCpep与FcHA的融合基因DCpep-FcHA由实验室保存,利用引物通过PCR引入酶切位点,进而将目的基因FcHA和DCpep-FcHA引入pFastBac 1载体中,测序鉴定后转化感受态DH10Bac,参照Bac to Bac?使用说明提取重组杆粒rBacmid-FcHA与rBacmid-DCpep-FcHA,分别转染Sf9细胞,获得rBV-HA和rBV-DCpep-HA,收集培养上清,经Western Blot鉴定表达蛋白正确。2、嵌合病毒样颗粒VLP-HA/HN及DCpep-VLP-HA/HN的表达与鉴定。利用昆虫杆状病毒表达系统构建重组杆状病毒rBV-HA和rBV-DCpep-HA,将构建好的rBV-HA和rBV-DCpep-HA分别与实验室已有的rBV-M和rBV-HN共转染Sf9细胞,表达VLP-HA/HN与DCpep-VLP-HA/HN。经Western Blot鉴定,蛋白表达正确。扫描电镜下观察可见直径80nm-200nm左右的病毒样粒子。3、重组病毒样颗粒VLP-HA/HN和DCpep-VLP-HA/HN的免疫及攻毒保护效果评价。商品化NDV-H9N2二联苗组采用肌肉注射的方式对SPF鸡进行免疫,VLP-HA/HN和DCpep-VLP-HA/HN组采用肌肉注射和点眼滴鼻的方式对SPF鸡进行免疫,免疫后对动物进行攻毒,检测体重,存活率、病毒载量、排毒时间几个指标,从而对实验动物的体液免疫,细胞免疫,和呼吸道黏膜免疫进行免疫效果评价。通过上述实验我们得到以下结论:（1）本实验构建的两种病毒样颗粒有完整的生物学形态以及良好的生物学活性。（2）嵌合病毒样颗粒可以诱导良好的体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫。综合免疫效果DCpep-VLP-HA/HN>VLP-HA/HN≥商品苗。（3）病毒样颗粒可以不添加佐剂使用,因此可通过点眼滴鼻途径免疫,点眼滴鼻产生的黏膜免疫效果要优于肌肉注射。（4）DCpep-VLP-HA/HN与传统疫苗相比,免疫途径简单,降低散毒风险,而且缩短病毒在鸡体内存在时间及病毒排出时间,能够体现出疫苗和强毒株基因型匹配的优势。