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第一部分:牙周韧带细胞脱细胞基质再生潜能研究研究目的本研究旨在探讨牙周韧带细胞脱细胞基质的制备,复合聚己内酯/明胶(Polycaprolactone/Gelatin,PCL/GE)电纺纤维膜和 15d-前列腺素 J2(15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2,15d-PGJ2)纳米粒的复合脱细胞牙周韧带基质模块在体内体外促进牙周骨缺损再生能力。研究方法采用组织块-酶消化法培养原代人牙周韧带细胞,免疫组织化学染色、HE染色、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色鉴定细胞来源;有限稀释法分离干细胞。抗坏血酸诱导形成细胞膜片,静态化学试剂法脱细胞,免疫荧光染色检测I型胶原蛋白、纤连蛋白的表达和分布,PicoGreen试剂盒检测脱细胞前后DNA含量变化,羟脯氨酸试剂盒检测总胶原蛋白含量变化,ELISA试剂盒检测生长因子bFGF、HGF、VEGF含量变化,扫描电镜观察牙周韧带细胞脱细胞基质结构完整性。体外接种人牙周韧带干细胞于牙周韧带细胞脱细胞基质进行再细胞化,免疫荧光染色检测纤连蛋白的表达和分布,ALP染色检测其成骨诱导能力。大鼠下颌骨构建牙周骨缺损模型(长×宽×深;4 mm×2 mm×1mm),植入含不同剂量(0,1.5μg,2.5μg,3.5μg)15d-PGJ2纳米粒的明胶海绵,术后3天、7天、14天收集缺损区软组织,采用蛋白质印迹法(Westernblot)评估炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平,探究15d-PGJ2纳米粒在大鼠牙周骨缺损的抗炎作用。在大鼠牙周骨缺损中分别植入明胶海绵、牙周韧带细胞脱细胞基质和PCL/GE电纺纤维膜负载牙周韧带细胞脱细胞基质复合物,三组都植入含1.5μg 15d-PGJ2纳米粒的明胶海绵,术后2周、4周收集下颌骨骨缺损段,采用Micro-CT检测缺损区愈合情况。结果(1)组织块-酶消化法培养5天后见长梭形原代人牙周韧带细胞爬出,免疫组织化学染色示波形丝蛋白染色阳性、细胞角蛋白染色阴性,ALP染色阳性。(2)抗坏血酸成功诱导形成人牙周韧带细胞膜片,静态化学试剂法成功制备牙周韧带细胞脱细胞基质。DNA含量在脱细胞后去除96.6%,脱细胞后胶原蛋白含量为113.6±1.804 mg/mL,增至脱细胞前的6倍;脱细胞前bFGF、HGF、VEGF含量分别是 8.494±3.608 pg/mL、2590±2.374 pg/mL 和 231.3±48.71 pg/mL,脱细胞后分别降低至 0.344±0.875 pg/mL(p=0.1062)、594.5±47.4 pg/mL(p<0.05)、30.97±5.43 pg/mL(p<0.05)。免疫荧光染色与扫描电镜影像显示脱细胞后的牙周韧带基质结构依然完整,脱细胞前后I型胶原和纤连蛋白都呈阳性表达,分布相似。(3)接种同种异体的人牙周韧带细胞于牙周韧带细胞脱细胞基质,对照组直接接种于孔底。第14天时,无论普通培养基或成骨诱导培养基培养,接种于牙周韧带细胞脱细胞基质上的细胞ALP染色都呈阳性,而直接接种在孔底的细胞仅成骨诱导培养基下呈阳性。(4)成功构建大鼠牙周骨缺损模型,Western blot结果显示低剂量15d-PGJ2纳米粒处理的大鼠下颌骨骨缺损处IL-1β和TNF-α的表达在术后第3天时与对照组相比有明显的降低(p<0.05),IL-6在四组间无明显差异(p>0.05);术后第7天四组的IL-6、IL-1 β和TNF-α的表达相比术后第3天下降,各组之间差异不明显(p>0.05);术后第14天四组的IL-6、IL-1β和TNF-α的表达相比术后第7天下降,各组之间差异不明显(p>0.05)。结果表明15d-PGJ2纳米粒具有早期抗炎作用。Micro-CT结果显示2周时牙周韧带细胞脱细胞基质组骨缺损开始愈合,其余组别骨缺损区未愈合;4周时对照组骨缺损区尚有部分根面暴露,牙周韧带细胞脱细胞基质组与脱细胞牙周韧带复合物组已大致愈合。2周时对照组、牙周韧带细胞脱细胞基质组与脱细胞牙周韧带复合物组骨体积分数分别是26.15%,52.94%,27.23%;4周时分别增长到53.23%,62.21%%,60.39%。结果表明牙周韧带细胞脱细胞基质有促进牙周骨缺损再生的能力;PCL/GE电纺纤维膜起机械支持作用,对骨缺损愈合无不良作用。结论(1)成功培养了人牙周韧带细胞并构建了牙周韧带细胞脱细胞基质,体内、体外实验验证了牙周韧带细胞脱细胞基质促进牙周骨缺损再生作用。(2)低剂量15d-PGJ2纳米粒具有局部抗炎作用。第二部分:游离龈移植用于植周角化组织增宽的疗效研究目的本研究的目的是探讨游离龈移植用于后牙区植周角化组织不足治疗的效果,评价术后植体植周健康、美学及患者主观满意度。研究方法本研究为病例系列研究,研究对象为后牙区接受种植手术的患者,且种植体周围角化组织宽度在2mm以内。经评估满足全口天然牙和植体探诊深度(Periodontal probing depth,PPD)不大于5mm,全口出血指数小于15%,植体平均牙龈指数(Gingival index,GI)不大于2的患者,排除手术禁忌症,将接受游离龈移植。术后2周、2月、6月定期随访,采集临床口内相、临床指数和患者视觉评分量表(Visual analogue scale,VAS)并分析。其中,临床指数包括角化组织宽度与厚度、牙龈退缩深度与宽度、GI、PPD和牙龈色形质评分评估植周健康和美学;患者视觉评分量表包括疼痛度VAS和满意度VAS进行患者主观评价。结果本研究共纳入植周角化组织不足患者8位,植体11颗。种植体在术后6月获得宽度4.5±1.60 mm,厚度1.8±0.70 mm的角化组织,植周探诊深度与牙龈指数处于正常范围,无植周黏膜炎或植周炎发生,仅一颗植体在术后6月发生牙龈退缩。植周色形质美学评价平均分4.7。患者的疼痛度VAS平均分4.7,满意度VAS平均分9.4(术后2月)和9.7(术后6月)。结论游离龈移植治疗后牙区植周角化组织不足可获得充分稳定的角化组织,维持植周健康,美学效果较好,患者疼痛较轻,但手术效果的长期稳定性尚需进一步随访观察。