表达苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的转基因Bt作物在全球范围推广种植,有效控制了重要作物上靶标害虫的为害,同时减少了化学杀虫剂的使用。Bt棉花自1997年开始在我国种植,目前Bt棉花种植面积已经占我国棉花总种植面积70%左右,Bt棉花的大范围推广,有效地抑制了棉花及其他寄主作物上棉铃虫的种群密度。鉴于在其他国家已经有田间害虫对Bt作物产生抗性进化的先例及在我国北方棉区部分田间种群对CrylAc敏感性下降的报道,棉铃虫对Bt棉花的抗性进化一直是Bt棉花持续应用的最大威胁。目前,主要依据对害虫室内Bt抗性品系的研究结果来制定相应的抗性检测方法和治理措施,高剂量/庇护所和基因叠加是现行的两种主要抗性治理策略。靶标害虫自然种群Bt抗性的进化过程比室内筛选品系复杂,因此,基于对田间种群抗性基因的检测鉴定及其抗性遗传方式的研究对建立更加合理的抗性监测和治理策略具有重要意义。为此,通过F1检测技术对来自长江流域和黄河流域的两个棉铃虫田间种群进行了抗性基因检测,鉴定到大量与室内抗性品系不同的抗性基因,发现了田间种群钙粘蛋白抗性等位基因的多样性。通过建立不同的田间抗性等位基因纯合品系进行抗性遗传互补研究,发现田间种群至少存在2种不同的抗性机制。Cry2Ab是基因叠加转基因棉花的一种重要候选基因,通过对河南安阳棉铃虫田间种群室内筛选获得了Cry2Ab抗性品系,并对其抗性风险进行了评估。本文的研究结果对于我国棉铃虫对Bt棉花抗性的监测和治理具有重要指导意义。1.棉铃虫江苏江浦种群钙粘蛋白基因突变的多样性通过F1检测对2008年江苏江浦棉铃虫田间种群进行了与CrylAc抗性相关的钙粘蛋白突变基因频率估算及鉴定。在本试验中,成功检测了123个采集自江苏江浦的田间棉铃虫与室内抗性品系SCD-rl(r1纯合子)杂交单对系的F1后代。在六个候选单对系中,共鉴定到5种不同的钙粘蛋白(Ha_BtR)突变等位基因(r4-r8)。在5个抗性基因中,由于在基因组DNA中发生碱基替换或插入突变而导致基因发生突变。在另外两个候选单对系中,检测到完整的钙粘蛋白等位基因,推测在两个单对系的田间亲本个体上,可能携带由于氨基酸点突变而导致钙粘蛋白受体功能丧失的抗性基因,或者携带其它位点的抗性基因。通过计算,2008年江苏江浦种群钙粘蛋白突变基因频率为0.024(0.010-0.055)。结合之前在棉铃虫中已经发现3个钙粘蛋白突变等位基因(r1、r2和r3)与Cry1Ac抗性相关,目前已经在我国3个棉铃虫田间种群中发现8个不同的钙粘蛋白突变基因,田间突变基因的多样性将严重影响DNA分子检测技术的有效性,F1检测技术用于棉铃虫田间种群的抗性基因检测将更加切实有效。2.棉铃虫河南安阳种群抗性基因频率检测及钙粘蛋白基因突变鉴定通过Fl检测对2009年河南安阳棉铃虫田间种群进行了与Cry1Ac抗性相关基因的频率估算及鉴定。在成功检测到的215个单对系中,发现34个候选单对的田间个体可能携带抗性基因,该地区田间棉铃虫种群对Cry1Ac的抗性基因频率为0.091(0.066-0.123)。在候选的阳性单对中,鉴定到胞内区缺失突变与可变剪接两种新型的钙粘蛋白突变基因,进一步丰富了田间钙粘蛋白基因突变的多样性。同时检测到大量正常翻译的钙粘蛋白等位基因,这些基因可能存在氨基酸替换引起的抗性突变。通过检测阳性单对系F1存活幼虫与室内敏感品系杂交后代,进行田间抗性基因显隐性鉴定,发现86%的田间个体携带隐性抗性基因,其余14%的个体携带非隐性抗性基因。尽管在田间种群中检测到大量个体携带隐性抗性基因,但通过间接和直接法预测田间存活个体的基因型,发现至少携带一个非隐性抗性基因的个体分别占80%和49%。在田间种群的抗性进化中,非隐性抗性基因在决定田间抗性个体频率中的贡献高于隐性抗性基因,因此研究和开发针对非隐性抗性基因的监测技术和抗性治理策略将更加重要和迫切。3.F1筛选获取的棉铃虫CrylAc抗性等位基因的遗传方式及遗传互补建立了5个不同的田间抗性等位基因纯合品系Jp14, An1, An29, An357, An156并进行了抗性分析。生物测定显示,与敏感品系SCD相比,5个抗性品系对Cry1Ac活化毒素分别具有128,215,41,881,121倍的抗性,对Cry2Ab毒素无交互抗性。通过与敏感品系的正反交和回交分析表明,Jp14为不完全隐性抗性,An1, An29, An357, An156为不完全显性抗性,5个品系均为常染色体,单基因遗传。通过与室内抗性生品系SCD-rl杂交进行遗传互补分析发现,Jp14, Anl, An29, An357品系中的抗性基因和SCD-r1品系的抗性基因均存在遗传互补作用,进一步验证了F1检测技术的有效性。An156品系可能为其它位点导致的不完全显性抗性。本研究表明：(1)F1筛选可以同时检测到隐性抗性等位基因和非隐性抗性等位基因；(2)棉铃虫钙粘蛋白抗性基因突变的多样性可以导致抗性水平和抗性遗传方式的多样性；(3)在选用抗性监测方法和设计抗性治理策略时,应充分考虑到棉铃虫田间种群中存在的非隐性抗性等位基因。4.棉铃虫Cry2Ab抗性品系的交互抗性及抗性遗传方式通过对2009年采自河南安阳的棉铃虫田间种群在室内用Cry2Ab4毒素进行连续筛选,获得了对Cry2Ab4具有高水平抗性的An2Ab品系。An2Ab抗性品系在筛选至第11代时与起始种群An相比,对Cry2Ab4具有262倍的抗性,同时对Cry1Ac活化毒素具有37倍的交互抗性。抗性遗传研究发现,在第11代时,An2Ab品系对Cry2Ab和Cry1Ac毒素同为不完全显性、常染色体遗传,对两种毒素的抗性都为多基因控制。继续用Cry2Ab4筛选的An2Ab品系在第20代时对Cry2Ab抗性升至636倍,同时对Cry1Ac活化毒素具有60倍的交互抗性。这是首次在棉铃虫中发现Cry2Ab抗性品系具有对Cry1Ac的交互抗性。尽管该品系是否可以在表达Cry1Ac和Cry2Ab的双价Bt棉花上存活需要进一步研究,我国棉铃虫具有同时对Cry1Ac和Cry2Ab产生抗性的潜力提示我们在选择应用表达Cry2Ab毒素转基因Bt棉花时应持谨慎态度。