桑黄菌丝体多糖的分离纯化、活性研究和结构分析

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Phellinus igniarius是在我国发现、并广为分布的桑黄菌种,其多糖具有良好的抗肿瘤、抗氧化和增强机体免疫功能的作用。有关Phellinus igniarius子实体多糖的活性和结构已有报道,而Phellinus igniarius菌丝体多糖的纯化、活性和结构分析报道较少。作者在采用Phellinus igniarius(菌株编号5.95)发酵得到菌丝体的基础上,对其中多糖的分离纯化、生物活性和一级结构进行系统的研究。主要结果如下:  摇瓶培养的桑黄菌丝体干燥、粉碎后,经热水提取,30%、60%和80%乙醇分级沉淀,得到三种桑黄菌丝体粗多糖IPS30、IPS60和IPS80,得率分别为3.89%、2.06%和1.67%;粗多糖分别采用DEAE-52纤维素离子交换柱和Sephacryl S-400凝胶层析柱分离和纯化,得到四种水溶性多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4,其多糖含量分别为90.88%、94.08%、92.15%和89.33%。采用HPSEC-RI-MALLS检测IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的纯度和分子量,结果表明四种纯化多糖均为均一多糖,且分子量分别为34.1 kDa,17.7 kDa,15.1kDa和21.7 kDa。蛋白质含量分析及UV检测均表明这四种均一多糖都不含蛋白质和核酸。  通过测定多糖对超氧阴离子、羟基自由基、DPPH·的清除以及还原能力来综合评价IPS30、IPS60和IPS80的抗氧化活性。结果表明:粗多糖IPS30、IPS60和IPS80,浓度均为0.40 mg/mL时,对超氧阴离子的清除率依次达到38.39%、52.98%、43.58%;对羟基自由基的清除率分别为91.46%、54.44%和58.89%;浓度均为0.7 mg/mL时,还原力依次为0.01、0.045和0.04;当浓度为2.0 mg/mL时,IPS30、IPS60和IPS80对DPPH·的清除能力分别为30.82%、57.03%和60.76%。综合四种实验结果,表明IPS30、IPS60和IPS80都具有较好的抗氧化性,且IPS30、IPS60和IPS80清除羟基自由基的能力高于清除超氧阴离子。  通过MTT法,测定均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的体外抗肿瘤活性。结果表明,四种均一多糖对HepG2和SW480的增殖均有良好的抑制作用,但对HGC的增殖无抑制作用。在浓度为70μg/mL时,IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4对HepG2的抑制率分别为39.0%、35.0%、25.0%和29.0%;在浓度为100μg/mL时,对SW480的抑制率分别为55%、35%、56%和26%。  采用间羟基联苯-硫酸法测定IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的糖醛酸含量,分别为7.42%、5.84%、7.82%和10.98%。通过红外光谱(IR)、气相色谱(GC)、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化和核磁共振等对均一多糖进行结构分析。确定IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4都属于α型D-葡萄吡喃糖。IPSW-1只含葡萄糖,其主链为Glc(1→6)和Glc(1→3,4),非还原性末端为Glc; IPSW-2只含葡萄糖,其主链为Glc(1→6)、Glc(1→3,4)和Glc(1→3,6),端基为Glc; IPSW-3只含葡萄糖,其主链为Glc(1→6)、Glc(1→3,4)和Glc(1→3,6),非还原性末端为Glc;IPSW-4含有鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,摩尔比为1.29∶1.21∶1.0∶43.86∶1.86,其主链为Glc(1→6)和Glc(1→3,4),支链为Rha(1→2),非还原性末端为Glc。刚果红实验显示IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4都不具有规则的三股螺旋结构。
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