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目的:已有大量的研究结果表明,神经病理性疼痛或外周组织炎症引起的炎性痛,都可引起机体发生热痛觉过敏和机械性痛觉过敏现象。痛觉过敏是一种以痛阈降低和/或对正常疼痛刺激的过激反应为特点的皮肤感觉异常现象,也称为痛觉敏感化。痛觉过敏的发生涉及到外周敏化和脊髓敏化,脊髓神经元内多种物质代谢改变及其引起的神经元兴奋性改变以及感受野扩大在痛觉过敏发生中起重要作用。近年来的一些研究结果还发现,结扎坐骨神经以及外周组织炎性痛可诱导脊髓神经元发生凋亡。我室采用甲醛炎性痛模型,发现足底注射甲醛溶液后24 h,脊髓神经元凋亡率即可明显增加,3天时凋亡达高峰。这些结果提示人们思考,疼痛引起的脊髓神经元凋亡和痛觉过敏之间是否存在某些关系,即神经元凋亡是否参与痛觉过敏的形成过程?目前,有关二者之间关系的研究已有一些相关报道,但研究结果并不一致。有研究报道,大鼠坐骨神经结扎后引起的脊髓神经元凋亡的程度与机械性痛觉过敏和热痛觉过敏程度相一致,但两者之间是否存在因果关系尚不能确定。研究者认为,二者有可能仅是神经病理性疼痛引起的两种表现形式而已。也有一些研究者采用抗凋亡因子人重组促红细胞生成素(erythropoietin, Epo)作为工具药,观察神经元凋亡与痛觉过敏的关系,发现应用Epo可明显减少神经元凋亡,并明显减弱大鼠的机械性痛觉过敏程度,因此认为,脊髓神经元凋亡参与了痛觉过敏的产生。总之,目前有关神经病理性疼痛以及炎性痛引起的神经元凋亡是否参与痛觉过敏的发生尚缺乏足够的证据加以确定。为了明确疼痛引起的神经元凋亡是否参与痛觉过敏的产生,本实验采用甲醛炎性痛模型。应用流式细胞术(flow cytometry, FCM)和末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记法( terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d-UTP nick end-labeling, TUNEL)观察甲醛炎性痛大鼠鞘内注射Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO对脊髓后角神经元凋亡的影响,并通过行为学方法观察凋亡抑制剂对甲醛炎性痛大鼠机械性刺激缩足反射阈值和热辐射缩足反射潜伏期的影响,探讨神经元凋亡在痛觉过敏形成过程中的作用。方法:126只雄性Sprague-Dawley大鼠,体重260-280克,随机分为两大组。第一大组84只动物,用于观察Caspase-3抑制剂对脊髓神经元凋亡的影响。将动物随机分为7个亚组,分别为正常对照组(Control组)、甲醛组(F组)、甲醛+生理盐水组(F+NS组)、甲醛+0.5 ng Ac-DEVD-CHO组(F+0.5 ng AC组)、甲醛+0.6 ng Ac-DEVD-CHO组(F+0.6 ng AC组)、甲醛+0.75 ng Ac-DEVD-CHO组(F+0.75 ng AC组)和甲醛+1 ng Ac-DEVD-CHO组(F+1ng AC组),每组12只动物。Control组不做任何处理,直接断头取腰4-5脊髓节段(L4-5)。F+NS组和F+各剂量Ac-DEVD-CHO组均预先鞘内注射NS或不同剂量Ac-DEVD-CHO,30分钟后足底注射甲醛溶液,各组动物均于足底注射甲醛后72 h断头取腰4-5脊髓节段(L4-5),其中6只行流式细胞术检测神经元凋亡率,6只用于TUNEL技术检测神经元凋亡情况。第二大组42只动物,用于观察凋亡抑制剂对甲醛炎性痛大鼠热辐射缩足反射潜伏期和机械性刺激缩足反射阈值的影响。实验动物同样随机分为7个亚组,分别为正常对照组(Control组)、甲醛组(F组)、甲醛+生理盐水组(F+NS组)、甲醛+0.5 ng Ac-DEVD-CHO组(F+0.5 ng AC组)、甲醛+0.6ng Ac-DEVD-CHO组( F+0.6 ng AC组)、甲醛+0.75ng Ac-DEVD-CHO组(F+0.75 ng AC组)和甲醛+1 ng Ac-DEVD-CHO组(F+1 ng AC组),每组6只动物。F+NS组和F+各剂量Ac-DEVD-CHO组动物均预先鞘内注射NS或不同剂量Ac-DEVD-CHO溶液,30分钟后足底注射甲醛溶液,分别于注射甲醛后1 d、4 d、7 d、10 d和14 d测定大鼠热辐射缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值。结果:1 Caspase-3抑制剂对脊髓神经元凋亡率的影响流式细胞术检测结果发现,Control组大鼠L4-5脊髓节段神经元的凋亡率很低。与Control组相比,F组大鼠脊髓神经元凋亡率明显升高;F+NS组与F组相比,大鼠脊髓神经元凋亡率无明显差别,表明鞘内注射NS对大鼠脊髓神经元凋亡率无明显影响;F+0.5 ng AC组大鼠和F组大鼠比较,脊髓神经元凋亡率无明显差异,增大Ac-DEVD-CHO剂量,F+0.6 ng AC组,F+0.75 ng AC组和F+1 ng AC组大鼠脊髓神经元凋亡率均较F组明显降低,其中F+0.75 ng AC组大鼠脊髓神经元凋亡率降低最为明显。2 Caspase-3抑制剂对脊髓神经元凋亡指数的影响TUNEL技术检测脊髓神经元凋亡情况发现,凋亡细胞中含有明显的棕黄色染色颗粒,这类细胞形态多呈不规则状。Control组大鼠脊髓后角偶见凋亡细胞。与Control组相比,F组大鼠脊髓后角中凋亡细胞数木明显增多,凋亡细胞和总细胞比值(即凋亡指数)明显升高;F+NS组与F组相比,大鼠脊髓神经元凋亡指数无明显差异;F+0.5 ng AC组大鼠和F组大鼠比较,脊髓神经元凋亡指数也无明显差异,但随着Ac-DEVD-CHO剂量的增大,F+0.6 ng AC组,F+0.75 ng AC组和F+1 ng AC组大鼠脊髓凋亡细胞明显减少,凋亡指数与F组相比均明显降低,其中,以F+0.75 ng AC组大鼠脊髓神经元凋亡指数降低最为明显。3 Caspase-3抑制剂对甲醛炎性痛大鼠热辐射缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值的影响与Control组相比,大鼠右后足底注射5%甲醛后,注射足底在注射甲醛后1 d,4 d,7 d和10 d热辐射缩足潜伏期均明显延长,机械刺激缩足反射阈值也均明显升高,表明注射足底对热和机械刺激反应迟钝,注射甲醛后第14 d时基本恢复正常。在注射甲醛后1 d,4 d,7 d,10 d和14 d,非注射足相应足底热辐射缩足潜伏期则明显缩短,机械刺激缩足反射阈值也均明显降低,表明非注射足发生了热和机械性痛觉过敏。甲醛炎性痛大鼠鞘内注射生理盐水后,大鼠的注射足和非注射足热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值在各观察时间点与F组相比均无明显差异。F+各剂量Ac-DEVD-CHO组与F组相比,注射足热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值均无明显变化;而非注射足热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值随着Ac-DEVD-CHO剂量的增大,其变化有所不同。分别表现为足底注射甲醛后1 d,各剂量组大鼠与F组大鼠比较,非注射足热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值均无明显改变;与F组相比,在各时间点F+0.5 ng AC组大鼠非注射足热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值均无明显差异,表明鞘内注射0.5 ng AC对大鼠热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值无明显影响;与F组比较,F+0.6 ng AC组大鼠仅在注射甲醛后4 d,非注射足热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值有所升高,而在注射甲醛后7 d,10 d以及14 d,0.6 ng AC对非注射足热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值影响不明显;与F组比较,F+0.75 ng AC组和F+1 ng AC组在注射甲醛后4 d, 7 d和10 d,大鼠非注射足热辐射缩足潜伏期均有所升高,机械刺激缩足反射阈值也明显升高,以上结果表明,鞘内注射一定量的Caspase-3抑制剂可降低大鼠热和机械性痛觉过敏程度。在注射甲醛后14 d,各剂量AC对大鼠非注射足热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值的影响均消失。结论:甲醛炎性痛可诱导大鼠脊髓神经元凋亡并可引起大鼠产生热和机械性痛觉过敏,鞘内注射一定剂量的Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO可明显抑制甲醛炎性痛诱导的脊髓神经元凋亡,并减轻大鼠热痛觉过敏和机械性痛觉过敏程度,提示脊髓神经元凋亡途径可能参与了痛觉过敏的形成过程。