人口老龄化所引起的机体组织器官衰老问题，已逐渐成为二十一世纪人口与健康领域的重大科学问题之一，也给整个生命科学和医学领域带来了严峻的挑战。衰老可以改变组织器官的生物学特性，导致机体结构和功能的失调，以及相关疾病的发生。肝脏是体内最大的实质器官，约占人体总重量的2%，具有储存、分泌、解毒等代谢功能。肝脏主要由肝细胞组成，肝细胞约占肝脏细胞的60%。肝脏是个体衰老过程中最易受累的器官之一。研究表明相对于年轻个体，老年个体更容易罹患肝脏疾病，如乙型或丙型肝炎、非酒精性脂肪肝、肝脏纤维化等，而且肝病患者治疗时年老个体的恢复能力也要明显弱于年轻个体。个体的衰老与器官和细胞的衰老有着密切的联系，肝脏的组织结构会随着年龄的增加而发生变化，如肝重比下降、肝细胞间出现许多空泡等；肝细胞也会呈现细胞衰老（cellular senescence）的特征性变化，如肝细胞体积增大、增殖能力下降、表达衰老相关半乳糖苷酶（senescenceassociated-β-galactosidase, SA-β-Gal）、细胞周期抑制因子p16ink4A、p21、p53表达增高、细胞核中组蛋白H2A的139位丝氨酸持续磷酸化（phosphorylation of Ser-139of histone H2A.X molecules, γ-H2A.X）等。另外，肝细胞多倍化（polyploidization）是肝细胞的重要特征之一，成年小鼠肝细胞中多倍体的比例占80-90%，而成年人肝细胞中多倍体比例也占到30-40%。多倍体又可以分成单核（mononucleated）、双核（binucleated）以及多核（multicleated）多倍体。一般认为，肝细胞的多倍体特征与肝细胞的发育及其成熟分化有关，而多倍体肝细胞的比例会随着年龄的增加而增加，这提示其可能与肝细胞的衰老密切相关。然而，目前还没有研究对发育中各个倍型的肝细胞进行单独分离并观察肝细胞倍型与细胞衰老的关系。更为特别地是，虽然肝细胞在发育成熟后几乎都处于静息状态、很少进入增殖周期，却保持着强大的潜在增殖能力，是体内唯一高度分化却仍具有增殖能力的细胞。在损伤刺激下，如经典的部分肝切术，剩余的静息状态的成熟肝细胞可以迅速进入细胞周期，通过再生补偿损伤或丢失的肝组织恢复肝脏的生理功能，即使连续肝切12次肝脏仍然能够再生。肝细胞连续移植的实验结果也显示，原代分离的肝细胞移植入受体肝脏内可以持续分裂增殖，分裂多达69次后也未减弱其增殖能力。反复肝切和肝细胞连续移植的研究提示我们，进入细胞周期的肝细胞在多次增殖分裂过程中，可能存在着某种机制抑制了肝细胞衰老的发生，从而使得这种无限增殖的现象脱离了常规的生命极限（Hayflick）概念，研究该状态下的肝细胞衰老抑制机制具有重要意义。另外，最近的一项研究表明，体内或体外增殖的肝细胞可以发生倍体转换（ploidy convey）现象，即高倍体肝细胞可以产生较低倍体的肝细胞包括二倍体细胞，二倍体肝细胞也会分裂产生高倍体肝细胞如四倍体和八倍体细胞。既然移植后的多倍体肝细胞可以通过倍体转换降低它的多倍性，如果肝细胞的多倍性与衰老的关系得以证实，那么倍体转换后肝细胞的衰老特性是否还将维持？衰老的肝细胞是否会发生返老还童（rejuvenation）？由于缺乏肝细胞可长期增殖并能有效控制的体内动物模型，以往开展的研究多侧重于肝脏的原位检测和整体表达水平分析，其缺陷是无法实现肝细胞与肝脏内其它细胞以及年轻与年老肝细胞的分离和纯化，从而对于肝细胞这一特定细胞群体的大规模细胞生物学和遗传学分析一直难以实现，对肝细胞衰老机制的阐明无法深入下去。在本项研究中，我们首先选择能指示细胞衰老的代表性指标（如SA-β-Gal、p16ink4A、p21、p53、γ-H2A.X、细胞增殖能力等）建立肝细胞衰老的评价体系，对不同年龄小鼠的肝细胞进行了衰老特性分析和评价。我们的结果显示随着年龄的增加肝细胞逐渐发生衰老，如SA-β-gal阳性细胞从2月龄的1.37±0.64%上升至12月龄的10.55±0.78%以及18月龄的40±4.6%，表明18月龄小鼠肝细胞中接近半数已进入衰老状态。其次，应用流式细胞术我们对不同年龄小鼠2、4、8三个倍体肝细胞进行了分析、分选和衰老指标分析，结果表明多倍体肝细胞比例随年龄增加而增高，且18月龄的8倍体肝细胞中γ-H2A.X阳性细胞的比例高达78.23±4.14%，明显高于2月龄8倍体肝细胞中的衰老细胞比例，这提示18月龄的多倍体细胞特别是8倍体与衰老有着密切的关系。进一步我们采用原位细胞核和细胞膜共染色的方法区别单核和双核的多倍体肝细胞，结果显示单核多倍体肝细胞或双核多倍体肝细胞的比例都随着年龄的增加而增高。更重要的是，我们首次通过原位衰老标志物（SA-β-Gal和γ-H2A.X）与细胞核和细胞膜共染色的方法，证明了随着年龄的增加多倍体肝细胞更易于衰老。实现特定肝细胞在体内的长期连续增殖，并对体内连续增殖的肝细胞特别是高倍体肝细胞进行分离或追踪分析，具有连续移植特性的FAH（fumarylacetoacetatehydrolase, FAH）基因剔除小鼠（简称Fah-/-小鼠）无疑是最理想的动物模型。本研究中我们以Fah-/-小鼠为模型，研究肝细胞在体内的连续增殖并对其衰老特性进行评价。结果表明，2月龄肝细胞作为供体细胞即使连续移植9或12次（每个移植周期是2个月），其增殖能力并没有减低的现象，即原代的2月龄肝细胞经过了18和24个月后仍具有同等的增殖能力，并且没有表现出衰老的特征，说明肝细胞在连续增殖中抑制了衰老的发生。更重要的是，当18月龄的年老肝细胞移植后，其中衰老的肝细胞不仅可以恢复增殖能力并再殖受体肝脏，而且再殖肝细胞中表达衰老标志的细胞比例明显降低，即衰老的肝细胞发生了返老还童。为了研究连续移植后肝细胞衰老抑制或逆转的主要机制，我们对年轻和年老供体肝细胞移植后的再殖肝细胞进行了细胞和分子水平分析。结果显示，随着年龄的增加正常小鼠肝细胞中端粒长度不会缩短，但其端粒酶活性却逐渐消失；而当年轻肝细胞连续移植以及衰老肝细胞体内再殖后，其端粒酶活性重新激活，这一激活机制可能与肝细胞端粒长度保持稳定并具有持续增殖能力的特性具有密切联系。研究中还发现，在体内增殖过程中肝细胞中细胞周期相关蛋白，如CDK2、CDK4、CDK6等的表达增加，有助于促进肝细胞进入细胞周期，而当肝脏再殖完全后这些蛋白又恢复至低表达水平。另外，与细胞衰老相关的p53-p21和p16ink4A-RB两条信号通路中p16ink4A、p21、p53的表达在衰老肝细胞再殖后明显降低。所以细胞周期抑制因子的低表达，也参与了肝细胞衰老抑制和逆转。重要的是，我们的研究还首次发现，肝细胞再殖过程中发生的倍体转换现象使得三个倍体肝细胞比例得以稳定保持，衰老肝细胞中高倍体细胞的比例降低可能是肝细胞衰老抑制或逆转的重要机制。肝细胞衰老抑制或逆转中倍体转换机制的参与有助于帮助我们了解肝脏中多倍体发生、发展及其转归机制，更有利于理解肝细胞返老还童恢复增殖能力的机制。上述我们已经证明小鼠衰老的肝细胞移植后具有返老还童的特性。进一步我们考虑如果人肝细胞移植后也能实现衰老的逆转，将会对老年肝细胞可能的潜在临床应用带来重大的参考价值。应用与小鼠肝细胞衰老研究相同的研究方案，我们证明了衰老的人肝细胞移植后也可以返老还童恢复至与年轻人肝细胞一样的增殖能力，进入细胞周期增殖的肝细胞其衰老特征消失。综合以上实验结果，我们可以得出结论：连续移植中的肝细胞在反复增殖的过程中具有衰老抑制的特性，移植的衰老肝细胞重新进入细胞周期后其衰老特性可以逆转，增殖过程中肝细胞衰老抑制或逆转的机制与端粒酶活性再激活、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子表达抑制、以及倍体转换发生有关。这一重要发现为理解肝细胞衰老的生物学问题、有效控制或延缓肝细胞衰老以及将年老肝细胞作为肝细胞移植的细胞来源，提供了理论基础和相关的技术手段。