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柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp. citri)引起的检疫性病害,危害严重,防治困难,寻找抗病柑橘资源、培育抗病品种可能是彻底解决这一病害的最佳途径。枸橼C-05是由国家柑橘改良中心长沙分中心经过多年筛选,最终确定的对溃疡病菌表现出过敏反应的抗病种质。探讨枸橼C-05的抗病机理,有望挖掘抗病相关基因,为抗病分子育种提供基因资源和理论指导,进而实现柑橘抗溃疡病育种的突破,解决这一产业难题。本研究以抗病枸橼C-05及感病品种冰糖橙接种病原菌前后的转录组测序数据为基础,通过GO功能分类、pathway代谢通路分析等生物信息学方法锁定了一批与抗柑橘溃疡病相关的候选基因,采用定量PCR技术分析了其表达模式,并检索了转录组测序数据中防御反应标记基因的表达情况。结合基因克隆测序和高灵敏度熔解曲线分析技术,分析了LYP2、CRRK1这两个抗病候选基因在抗、感病材料接种病原菌前后的转录本差异。克隆了抗病相关候选基因的gDNA、cDNA及其启动子序列,对候选基因的蛋白序列和启动子序列作了一系列生物信息学分析,包括蛋白结构与功能以及启动子序列的关键结构和顺式作用元件。同时,构建抗病相关候选基因的植物表达载体以及启动子与报告基因的融合表达载体,采用农杆菌介导的柑橘基因瞬时表达系统分析了候选基因及其启动子的功能。此外,还应用双分子荧光互补技术分析了LYP2和CRRK1表达产物之间的互作关系。主要研究结论如下：1、在响应溃疡病菌入侵的过程中,抗病相关候选基因LYP2和CERK1在冰糖橙叶片中下调,而在枸橼C-05中的相应阶段上调表达；LYPl和imp-a在抗、感病材料中均存在上调表达阶段,但趋势一致,而SRP54的表达量则没有明显变化。此外,6个防御反应标记基因(β-glu、PAL-1、PAL-2、MLO-1、MLO-2、WRKY13)在冰糖橙中没有转录水平变化,而在枸橼C-05中则有明显上调阶段。2、LYP2, CERK1基因的cDNA和gDNA序列比对结果显示,冰糖橙和枸橼C-05的LYP2基因(CsLYP2, CmLYP2)均由5个外显子和4个内含子构成,CsLYP2和CmLYP2的基因全长分别为3324和3318 bp,同源性为98.11%,cDNA全长均为1077bp,编码358个氨基酸,cDNA和氨基酸同源性分别为99.07%和97.77%;CsCERKl和CmCERKl基因没有内含子,cDNA全长均为2010 bp,编码669个氨基酸,cDNA和氨基酸同源性分别为98.46%和96.41%。蛋白结构功能预测结果表明,LYP2蛋白包括信号肽和两个串联的富赖氨酸基序(LysM motif), CERK1由信号肽,跨膜结构,富赖氨酸基序和蛋白激酶结构域构成。CERK1的关键功能结构域存在8处氨基酸差异,其中CsCERK1-1/2的358-361号氨基酸形成β-折叠,CmCERK1-1的359-360号氨基酸形成β-折叠,而CmCERK1-2的β-折叠消失。LYP2的关键功能结构域存在3处氨基酸差异,但二级结构完全一致。3、转录本分型结果表明,接种病原菌前后,LYP2基因的转录本在冰糖橙中的比例均为3：2,在枸橼C-05中只有一种类型的转录本,冰糖橙中两种类型的转录本分别来源于两个等位基因,而非病原菌诱导产生新的转录本；接种病原菌后,CERK1基因受病原诱导而出现了新的转录本,在冰糖橙和枸橼C-05中的比例分别为3：2和3：1,但新转录本的出现与该基因的表达水平可能没有必然联系。4、冰糖橙和枸橼C-05的LYP2基因启动子(pCsLYP2, pCmLYP2)序列大小分别为1607和1956 bp,同源性为58.56%。序列中的水杨酸顺式作用元件、茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应顺式作用元件、与植物防卫基因激活相关的顺式作用元件W-box、TATA-box等大部分顺式作用元件都是两者共有的。而厌氧诱导调节顺式作用元件(ARE motif)、参与防卫和胁迫响应的作用元件(TC-rich repeats)和缺氧诱导增强子元件(GC-motif)则只存在于pCsLYP2序列,pCmLYP2则没有以上3个元件,但有一个防卫机制相关的调控元件TCCACCT-motif。5、瞬时表达分析结果表明,pCsLYP2和pCmLYP2启动子均具备启动子功能,而接种病原菌时,pCmLYP2启动子活性受病原菌诱导而增强,pCsLYP2则没有增强。pCmLYP2启动子可能在感受溃疡病菌侵染时发挥重要作用。6、冰糖橙LYP2基因的不同转录本对应的蛋白CsLYP2-1和CsLYP2-2分别自身形成聚合体。同样,枸橼C-05的LYP2蛋白也能形成聚合体,而CERK1可能不与LYP2直接结合,且自身不形成聚合体。7、LYP2和CERK1基因的瞬时表达结果表明,两个基因不同转录本的表达产物,除CsLYP2-1外,均可以短期内抑制溃疡病菌的增殖。同时也进一步印证了这两个基因在接种病原菌的抗、感病材料中出现差异表达与上游启动子结构相关。