肝细胞性肝癌（简称肝癌,Hepatocellular Carcinoma,HCC）是我国最常见的高发肿瘤之一,其发生发展是由体内多基因参与、多步骤协同的复杂过程。目前,尽管已经鉴定了一些肝癌相关的抑癌基因,如p53和p16 INK4a,并明确了它们在肝癌中的特异性失活,但是在肝癌发生中特异性激活的癌基因却少见报道。2000年日本科学家Fujita等人应用消减杂交法从人肝细胞癌组织高表达的基因中筛选出一条编码重复ankyrin（ANK）序列的新基因,命名为gankyrin。我们检索基因库后发现gankyrin基因与1998年Hori等人发现的p28（Nas6p）基因序列完全一致,遂将其命名为p28^GANK。癌基因p28^GANK编码的蛋白是人26S蛋白酶体（26S proteasome）调节亚单位19S/PA700复合物的一种非ATP酶亚基,其核酸序列中含有5个串联排列的ANK重复单位,其保守的ankyrin序列介导蛋白与蛋白间的相互作用。26S蛋白酶体中的20S蛋白小体是降解体内某些错误折叠蛋白或细胞周期蛋白的场所,目前尚不清楚癌蛋白p28^GANK在26S蛋白酶体降解蛋白过程中的具体分子作用机制。前期研究发现癌蛋白p28^GANK参与CDK4/CyclinD1/p16INK4a/Rb1/E2F-1信号传导通路的调节,此通路的失调控在肝癌的发生发展过程中具有相当重要的作用;外源性转入癌基因p28^GANK使其高表达后的NIH/3T3细胞株可以使裸鼠荷瘤。最近,Nagao等人通过酵母双杂交发现黑色素瘤抗原MAGE-A4能与癌蛋白p28^GANK特异性的结合并抑制p28^GANK成瘤活性。NF-κB在调节免疫、炎症反应,粘附分子表达,生长控制以及细胞凋亡过程中发挥着重要作用,它能被多种因素激活,包括细胞因子TNF-α、IL-1β、细菌脂多糖（LPS）、T细胞白血病病毒表达的Tax蛋白、佛波脂及紫外线等等。NF-κB的活化机制分为两大通路,其中之一是经典的IKK激酶活化促使IκB磷酸化降解途径,另一条是非经典的B细胞受体途径即p100加工裂解为p52后导致RelB/p52复合体入核,这两条途径都依赖于IKK激酶活性和26S蛋白酶体降解。Ryan等人发现p53介导的凋亡需要NF-κB的活化,RelA缺失的小鼠成纤维细胞拮抗p53介导的凋亡。基于不同的环境包括细胞类型和不同的诱导因子,NF-κB在抑制凋亡和促发凋亡中发挥着双重作用。新近研究发现p28^GANK能与泛素蛋白连接酶MDM2相互作用,介导野生型p53蛋白的泛素化及降解,说明在肝细胞癌中存在着癌蛋白p28^GANK负调控野生型p53的抗凋亡机制。结合我们前面的研究结果下调p28^GANK在肝癌细胞中的表达可引发细胞凋亡,提示p28^GANK可能与NF-κB通路间存在着某种联系。此外在结构上,p28^GANK含有5个串联排列的ANK重复序列,该序列介导蛋白与蛋白间的相互作用。ANK重复序列是由33个氨基酸组成的基序,以多拷贝串联形式存在于多种蛋白质中。作为NF-κB活性的主要抑制因子IκBs蛋白家族也含有6个ANK重复序列,其中IκBαC端的两个ANK与NF-κB结合并抑制NF-κB活性。所以,鉴于ANK蛋白的背景知识和p28^GANK基因编码的蛋白含ANK序列的结构特点,我们推测p28^GANK蛋白很可能以其ANK序列与NF-κB相互作用进而影响NF-κB信号转导通路。虽然近年来对p28^GANK基因的研究也在深入,但它与NF-κB之间的作用和联系尚未见报道。我们预实验结果显示,癌蛋白p28^GANK的高表达和低表达均可调控NF-κB的出入核及转录活性,且不依赖于IκBα蛋白的磷酸化及表达量的变化,提示癌蛋白p28^GANK可能以独特的方式调控NF-κB信号通路。因此,癌蛋白p28^GANK调控核转录因子NF-κB信号通路机制的探讨是极有意义的。实验方法:1.构建p28^GANK和IκBαGST融合质粒,构建含有Myc标签的p28^GANK全长及各种突变体融合质粒,含有Flag标签的RelA全长及各种突变体融合质粒;2.运用双荧光素酶报告基因系统检测外转p28^GANK对NF-κB转录活性的影响;肿瘤细胞系经腺病毒介导的RNAip28^GANK 24-72hr后,反向观察下调p28^GANK对NF-κB转录活性的影响;3.通过核抽提、EMSA和Suppershift技术,293T细胞瞬转p28^GANK后检测NF-κB DNA-binding活性的变化（其间外转RelA或TNF-α10ng/ml刺激以提高293T细胞NF-κB的本底水平）;肿瘤细胞系经腺病毒介导的RNAip28^GANK后检测DNA-binding活性的变化;4.运用Western blot及核浆分离技术,检测293T细胞瞬转p28^GANK后,NF-κB的RelA/P65亚基在胞核胞浆中的分布变化;肿瘤细胞系经腺病毒介导的RNAip28^GANK后RelA/P65在胞内的分布变化;5.运用细胞免疫荧光技术检测293A细胞共转p28^GANK和NF-κB（RelA/P65）后,NF-κB RelA/P65在细胞内定位的变化;通过RNAi干扰HeLa内源性的p28^GANK后,反向观察细胞内源性NF-κB RelA /P65在细胞内定位的变化;6.构建IκBα、IκBβ和IκBεRNA干扰质粒,选用HepG2,HeLa和HEK293细胞建立IκBα、IκBβ和IκBε共同下调稳定细胞系（又称为3KD细胞）,检测p28^GANK在3KD细胞中对NF-κB转录活性、DNA-binding及细胞内分布的影响;7.运用免疫共沉淀（IP）、GST-pull down和激光共聚焦技术研究p28^GANK与NF-κBRelA/P65及其各种突变体是否存在直接相互作用;8.运用Western blot和IKK激酶活性分析技术检测293T细胞外转p28^GANK和肿瘤细胞下调p28^GANK后,IKK磷酸化、蛋白量以及激酶活性的改变;9.化学合成针对RSK-1的小干扰RNA（siRNA）,检测p28^GANK在p53缺失的细胞中或干扰下调RSK-1的情况下对NF-κB活性的调控;10. Western blot检测293T细胞外转的p28^GANK及肿瘤细胞中内源的p28^GANK对TNF-α、LPS和IL-1β等刺激的应答变化。结果:1. p28^GANK抑制本底和几种处理（共转RelA/P65或TNF-α刺激）活化的NF-κB转录活性,选用高表达p28^GANK的HepG2（p53野生型）、Hep3B（p53缺失型）、HuH-7（p53点突变型）和HeLa（p53野生型）四种肿瘤细胞系,经腺病毒介导的RNAi干扰p28^GANK 24-72hr后,NF-κB转录活性升高;2.发现p28^GANK通过抑制异源二聚体RelA/p50与DNA的结合,减弱NF-κB DNA-binding活性,肿瘤细胞系经腺病毒介导的RNAi干扰p28^GANK后NF-κB DNA-binding活性增强;3. Western blot和细胞免疫荧光显示293T细胞瞬转p28^GANK后,随着p28^GANK量增加,RelA总量不变,但由胞核转至胞浆,内源的IκBα不受影响;Hep3B、HepG2和HeLa细胞经腺病毒介导的RNAi p28^GANK后RelA重新入核;4.在3KD细胞中,p28^GANK仍可调控NF-κB的转录活性和DNA-binding活性,即p28^GANK对NF-κB的调节不依赖于IκBs蛋白;5.免疫共沉淀（IP）、GST-pull down和激光共聚焦结果显示p28^GANK与NF-κB/RelA直接相互作用,并利用其N端的出核序列,通过CRM-1途径促使NF-κB/RelA出核;6. Western blot技术和IKKβ激酶活性分析表明293T细胞外转p28^GANK和肿瘤细胞下调p28^GANK不影响IKKβ的磷酸化状态、表达量以及激酶活性,即p28^GANK对NF-κB/RelA的调节不需要IKKβ的参与;7.在p53缺失的细胞中或下调RSK-1的情况下,p28^GANK仍可调控NF-κB/RelA的活性,即p28^GANK对NF-κB/RelA的调节不依赖于p53-RSK1通路; 8.内源及外源p28^GANK对TNF-α、LPS和IL-1β等刺激不应答,p28^GANK对NF-κB/RelA活性的调控不受这些促炎刺激的影响。结论:肝癌癌蛋白p28^GANK可与RelA直接结合并通过CRM-1途径促使其出核,进而使RelA阻滞于胞浆并明显地抑制其转录活性。下调肝癌细胞中p28^GANK的表达使NF-κB复合物在胞浆中得以释放、游离并重新入核结合靶DNA而活化。在3KD细胞及p53缺失的细胞中,p28^GANK仍可与RelA直接结合并明显地抑制NF-κB/RelA的活性,这表明p28^GANK对NF-κB/RelA活性的调节与IκB家族无关且不依赖p53-RSK1通路。同时,p28^GANK引起的NF-κB胞浆阻滞对各种促炎刺激不应答,而且过表达或下调p28^GANK调控NF-κB活性的过程不需要IKKβ的参与,这些结果表明p28^GANK对于NF-κB/RelA活性的调节是一不同于传统方式的全新分子机制。近来有人报道了另一肝癌癌蛋白HSCO （ Hepatoma Subtracted-cDNA library Clone One）也可直接促使NF-κB出核而抑制其活性,由此抑制p53引发的凋亡,这提示在肝癌信号网络调控中确实存在新的非经典的NF-κB调节途径。我们认为,p28^GANK作为一全新的NF-κB/RelA活性调节子,在RelA的胞浆阻滞和刺激不应答过程中发挥着独特的作用,这是对NF-κB通路调控机制的新发现和补充,亦有助于我们进一步阐明肝细胞癌发生发展过程中精细分子机制。