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黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属病毒典型代表种,其外壳蛋白(Coat protein,CP)位于病毒粒子的最外层,与病毒的胞间运输和长程运输、蚜虫传播等密切相关,是CMV重要的症状决定因子。光合作用是绿色植物最重要的生理生化活动之一,主要由叶绿体蛋白控制和调节。植物病毒的侵染通常导致植物叶绿体损伤和叶绿体蛋白的功能失调。深入理解和研究病毒蛋白-叶绿体蛋白的相互作用,对揭示植物病毒致病机理和植物抗病毒机制具有重要意义。本实验室的前期研究以CMV CP为诱饵从番茄cDNA文库中大规模筛选到9个与CMV CP互作的光合作用相关蛋白,本研究选取其中6个蛋白基因进行进一步验证,主要研究成果如下:以健康番茄总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆6个候选基因的完整编码区(CDS),构建pPR3-N-目的基因的猎物载体,分别与CMVCP诱饵表达载体共同转化酵母菌株NMY51,涂布于不同的营养缺陷型选择培养基平板,结果显示,在酵母菌中,二磷酸核酮糖羧化酶小亚基2a小链(rbcs 2a)(克隆编号E104)、二磷酸核酮糖羧化酶小亚基3b小链(rbcs 3b)(克隆编号B3)、光系统II1OKDa多肽PsbR(克隆编号E57)、光系统II中心复合体蛋白psbY(克隆编号E161)与CMV CP存在相互作用,而光系统II中心复合体蛋白PsbW(克隆编号D15)和原叶绿素酸脂酸脂质还原酶(克隆编号D68)与CMVCP不存在相互作用。分别构建CMV CP及在酵母菌中与CMV CP互作的4个光合作用相关基因的双分子荧光互补载体Y~N-CMV CP和Y~C-B3、Y~C-E57、Y~C-E104、Y~C-E161,将含有Y~N-CMVCP的农杆菌菌液与分别含有Y~C-B3、Y~C-E57、Y~C-E104、Y~C-E161的农杆菌菌液共同注射烟草,激光共聚焦显微镜观察结果显示所有处理均可发出黄色荧光,说明在烟草叶片中CMV CP与上述四个蛋白互作,与酵母双杂交的结果一致。初步确定CMV CP与互作蛋白的互作功能域。将CMV CP基因序列分成三段:1-327bp(CMVCP-1)、163-489bp(CMVCP-2)、328-654bp(CMV CP-3)分别构建双分子荧光互补载体,即Y~N-CMVCP-1、Y~N-CMVCP-2、Y~N-CMV CP-3,分别与 Y~C-B3、Y~C-E57、Y~C-E104、Y~C-E161转化农杆菌注射烟草,,激光共聚焦显微镜观察,结果显示:Y~N-CMVCP-1、2、3+Y~C-B3,Y~N-CMVCP-1、3+Y~C-E57,Y~N-CMVCP-1、2、3+Y~C-E104,Y~N-CMVCP-1、2+Y~C-E161有黄色荧光;Y~N-CMVCP-2+Y~C-E57,Y~N-CMVCP-3+Y~C-E161无黄色荧光。表明CMV CP具有多个与寄主蛋白的互作位点,且CMV CP与不同的寄主蛋白互作位点不同。为进一步分析CMV CP与B3、E57、E104、E161的互作位点,通过同源建模软件模拟 CMV CP、CMV CP-1、CMV CP-2、CMV CP-3 的二级结构和三级结构,推测CMV CP的活跃位点可能位于CMV CP氨基酸序列的第76-84、127-136、154-164、189-199位氨基酸处,均为β转角。论文研究进一步证明了番茄中4个光合作用相关蛋白与CMV CP互作,同时预测了可能的互作位点,为今后深入研究CMV的致病机理奠定了坚实的基础。