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本课题初步建立了怀地黄毛状根的遗传转化及其梓醇HPLC测定体系和植株再生体系,对怀地黄转化的几种影响因素以及激素对毛状根再生植株的影响进行了研究,所得结果如下:发根农杆菌15834菌液的OD值在0.65~0.8之间时,可以有效地用于转化;当发根农杆菌与外植体共感染时间为30min时毛根诱导,毛根诱导效果比较好,毛根诱导率为44.7%,毛根诱导密度为5.84;10~15d叶片的毛根诱导率及毛根诱导密度最高,分别达44.0%和5.8;乙酰丁香酮有助于毛根诱导密度的提高,但对提高毛根诱导率的作用不很明显。经过抗生素除菌和Kanr筛选方法获得了毛状根株系,对毛状根进行了PCR和冠瘿碱检测,证明发根农杆菌Ri质粒的T-DNA区转入毛状根并在其中表达冠瘿碱产物。HPLC检测在1/2MS液体培养基中振荡培养35d的毛状根梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄的48.5%,是生地黄的18%。而培养35d的正常未转化的怀地黄根中未检测到梓醇。毛状根在附加KT0.2mg/L和6-BA3mg/L的1/2MS培养基上培养2~3周获得了了再生植株。再生率较低,约为40%。冠瘿碱纸电泳和PCR电泳检测转化再生植株叶片发现其中被转入了发根农杆菌Ri质粒的T-DNA区(rolB基因),表达冠瘿碱产物。对转化再生植株和未转化植株进行的同工酶分析结果表明,POD分析时,未转化叶片表现出两条带a和b,而转化植株除了在相同的距离也有两条带外,在近点样点端还有一条带c,转化植株中的带a比未转化中的颜色浅且窄,活性相对较弱,带b比未转化中的颜色深且宽,活性相对较强;EST分析时,未转化植株和再生植株均只显现出一条带,再生植株中的带比未转化中的颜色浅且窄,活性相对较弱。
另外,利用RAPD和ISSR分子标记技术分析了怀地黄85-5品种内遗传多样性。从24个RAPD引物和43个ISSR引物中分别筛选出具有稳定多态性条带的RAPD引物3个和ISSR引物2个,分别对地黄85-5品种的16个单株基因组DNA进行PCR扩增。3个RAPD引物共扩增出7条带,其中多态性条带为4个,多态性比率为57.14%。2个ISSR引物共扩增出17条带,其中多态性条带为11个,多态性比率为64.7%。结果表明,怀地黄85-5品种内存在一定的遗传多样性,但比地黄品种间的遗传多样性较低。