论文部分内容阅读
牛结节皮肤病(Lumpy skin disease,LSD)是由牛结节皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV))引起牛的一种急性、亚急性、慢性的高度接触性传染病。该病可以引物感染的怀孕母牛流产甚至不孕、公牛暂时性失去孕育功能,产奶母牛产奶量下降,感染牛机体消瘦,因皮肤上布满结节而导致皮革利用率低。该病可感染不限品种和年龄的牛,感染任何年龄阶段的牛,其中犊牛死亡率可达100%,成年牛的死亡率在3%-10%。世界动物卫生组织(The World Organization for Animal Health,OIE)将其列为必报动物疫病之一,我国也将其列为Ⅰ类动物疫病。2019年我国新疆伊犁发现第一例牛结节皮肤病。该病的主要传播方式是通过吸血节肢昆虫为媒介,这些昆虫会随季节气候变化而进行大量繁殖和迁徙。因国际贸易往来逐年增加,货物运输工具的便利,也会导致该病的传播,这是因为这些吸血昆虫会随交通工具而去往没有发生该病的地区。增加了该病的在全球传播的机率。所以需要研发新的有效的监控及其预防方法。目前对该病的主要防控手段为接种弱毒疫苗,尚无药物治疗。弱毒疫苗在使用过程中会出现局部皮肤不良反应,弱毒疫苗的泄露容易造成环境污染而导致牛群感染。此外,因异源弱毒疫苗的宿主特异性,还潜在感染山羊、绵羊的风险。不仅如此弱毒疫苗在动物机体及其环境中的进化可能会存在毒力回归变高的风险。所以需要寻求一种新的高效稳定的疫苗来预防控制牛结节皮肤病。昆虫杆状病毒表达系统是一种高效的蛋白表达系统,也是真核细胞中常用于生产病毒样颗粒疫苗的系统之一。本研究通过昆虫杆状病毒表达系统表达牛结节皮肤病特异性基因ORF132,通过杆状病毒表达系统构建重组杆状颗粒样疫苗并对其免疫原性进行研究,为进一步研发牛结节皮肤病的新型疫苗奠定基础。本研究通过对目的基因的筛选,通过密码子优化目的基因ORF132并构建重组杆状病毒(AcMNPV-ORF132与AcMNPV-Y-ORF132)。AcMNPV-ORF132与AcMNPV-Y-ORF132能在Sf9细胞中进行表达,通过His标签抗体检测结果为其蛋白大小约为26KD,比预期大6KD,密码子优化后的AcMNPV-Y-ORF132比未优化的AcMNPV-ORF132的表达量高。经密码子优化后的Y-ORF132其密码子适配指数(Codon Adaptation Index,CAI)由优化前的0.62提高至0.98,G+C含量由25%增加至52%,最偏嗜密码子比例由35%提高至89%,更适合昆虫杆状病毒表达。通过对AcMNPV-Y-ORF132增殖曲线及病毒滴度的测定,其随着时间的增加其病毒的量及其滴度是增加的。通过间接免疫荧光证明ORF132重组蛋白在Sf9细胞中表达。为探索AcMNPV-Y-ORF132在Sf9细胞中的表达条件对接种细胞数量、病毒感染复数、病毒感染时间进行优化,经Western-Blot分析,最佳细胞接种密度为1.6×10~6个/m L;最佳感染复数为1;最佳收获蛋白时间为96h。本试验还通过将AcMNPV-Y-ORF132感染家蚕经qPCR检测家蚕体内核酸,结果表明:Y-ORF132重组杆状病毒能在家蚕体内复制增殖。将纯化后AcMNPV-Y-ORF132颗粒,经腹腔注射免疫小鼠,通过对小鼠脾淋巴细胞、特异性抗体及抗体滴度测定,结果证明Y-ORF132重组杆状病毒颗粒具有很好的免疫原性。