胶质母细胞瘤是中枢神经系统中常见的恶性肿瘤,同时也是恶性程度最高的肿瘤之一,其发病率可达3～5/10万。中枢神经系统肿瘤分类标准(世界卫生组织2007年)将胶质瘤分为四种病理亚型(WHOI-Ⅳ级)。由于WHO Ⅳ级胶质母细胞瘤生长速度快,患者症状较重,而且往往短期内复发,预后多不良。目前临床医生即使采用手术为主,放化疗为辅助的综合治疗,胶质母细胞瘤患者的中位生存期也仅有12～14个月。近年来,研究人员对胶质母细胞瘤发病机制进行了大量研究,但是对其确切的发病机制并未揭示。得益于分子生物学的发展,分子靶向治疗有可能为胶质母细胞瘤患者带来新希望。因此,寻找与胶质母细胞瘤发生和恶性进展的相关的分子迫在眉睫。正常细胞的恶性转化常伴随着细胞能量代谢的重塑,这种代谢重塑被称为Warburg效应,即肿瘤细胞主要通过糖酵解提供能量,即使在供氧充足的情况下也是如此。相比于线粒体介导的有氧呼吸,糖酵解虽然产能效率较低,但是可以为细胞组分的合成提供必要的大分子原料,并可重塑细胞生长的微环境,增强肿瘤细胞凋亡耐受和侵袭能力,是肿瘤抵抗治疗及复发的关键机制。研究表明,Warburg效应在多种肿瘤中广泛存在,胶质母细胞瘤也不例外。但是到目前为止,Warburg效应具体的分子机制仍不十分明确。Polycomb group(PcG)蛋白作为一组非常重要的转录因子,在细胞多种生物学功能中发挥着重要作用。PcG蛋白组分虽然在结构上并不相似,但是其功能保持一致性,通过对组蛋白的表观遗传学修饰,对下游靶基因起到转录调控作用,因此其被划分为同一个家族。PcG蛋白最初在果蝇中被发现,随着研究的深入,人们发现其存在于包括人类在内的多个物种,而且序列高度保守。PcG蛋白通常通过构成两种蛋白复合体发挥作用,多梳蛋白抑制复合体1(Polycomb expressive complex1,PRC1)和多梳蛋白抑制复合体2(Polycomb expressive complex2,PRC2)。EZH2 蛋白是 PRC2 中重要的催化亚基,其可以通过调控组蛋白H3K27的甲基化水平来实现对靶基因的转录抑制。EZH2通常在胚胎时期表达水平较高,待细胞分化成熟后表达降低。目前的研究表明EZH2在多种肿瘤中表达显著上调,包括乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌和肺癌,以及肉瘤和胶质母细胞瘤等。并且,EZH2与这些肿瘤的发生、进展、转移和不良预后密切相关。进一步的研究发现大多数的EZH2靶基因属于肿瘤抑制基因,如对于肿瘤细胞增殖和侵袭有重要意义的 INK4B-ARF-INK4A,p57,BMPR1B,MyoD 和 RUNX3 等。与肿瘤侵袭、迁移有关的CHD1基因以及与肿瘤血管发生相关的Bim,TRAIL,FB032三种分子均可受到EZH2的调控抑制。早在2009年,Liu等首次发现作为PRC1重要组分的Bmi1蛋白在线粒体代谢中发挥着重要作用,但是作为PRC2核心组分的EZH2是否参与并影响肿瘤细胞能量代谢的重塑机制目前尚未见报道。HMGA1是另一重要蛋白家族,高迁移率蛋白(High mobility group proteins,HMGs)的成员之一,目前研究较为广泛。HMGA1能够结合DNA的AT序列富集区,通过蛋白-蛋白和蛋白-DNA相互作用改变染色质的结构,进而调节转录过程。同时,HMGA1能与许多转录因子相互作用并且调节其活性,包括 NF-κB,ATF-2/c-Jun,Elf-1,Oct-2,Oct-6,SRF 和 NF-Y 等。和 EZH2类似,HMGA1在胚胎发育的过程中高表达,在成人分化成熟的细胞中表达量下降,而在多种恶性肿瘤中其表达显著上调。已有研究证实,HMGA1在包括胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌和胶质瘤等多种恶性肿瘤中高表达。如在胰腺导管腺癌中,HMGA1的高表达预示着肿瘤恶性程度高,患者生存期短。我们先前的研究也表明,HMGA1在不同级别的胶质瘤中的表达水平不同,其表达水平与胶质瘤的病理级别、增殖、转移、血管生成能力成正相关,但是作为一种高复发性肿瘤,HMGA1在胶质母细胞瘤复发中的作用及机制尚不明确。本课题分为两部分,第一部分研究EZH2对胶质母细胞瘤能量代谢的影响和具体机制,第二部分初步探究了 HMGA1与胶质母细胞瘤复发和预后的关系。第一部分:EZH2对胶质母细胞瘤能量代谢的影响及机制研究一、EZH2在胶质母细胞瘤糖酵解过程中的作用我们将 SC-shRNA,EZH2-shRNA,pJAX-SC,pJAX-EZH2 分别转染进U251和T98G细胞构建EZH2敲除和过表达的细胞模型。脱氧葡萄糖检测结果表明,当细胞中的EZH2表达升高时,细胞的脱氧葡萄糖摄取量明显升高,EZH2表达降低后则会呈现相反的结果。qRT-PCR、酶活性检测和乳酸生成检测结果显示,U251和T98G细胞过表达EZH2后,细胞中有关糖酵解的三种酶类:HK2、PKM2、PFK1表达及活性都得以增高,同时乳酸的分泌量增加。以上结果表明,在胶质母细胞瘤中过表达EZH2可以提高细胞糖酵解代谢水平。我们进一步通过美国海马细胞能量代谢实时测定仪检测EZH2敲除的U251和T98G细胞耗氧率(OCR)的变化,并先后加入寡霉素和FCCP解偶联剂,结果显示,肿瘤细胞自身的氧耗量呈现出先降低后升高的趋势。EZH2敲除后,胶质母细胞瘤细胞氧耗率和耗氧能力的储备值都显著降低,而EZH2的过表达则对胶质母细胞瘤细胞OCR影响不大。另一方面,细胞能量代谢实时测定仪对胶质瘤细胞细胞外酸化率(ECAR)的检测结果表明,EZH2的表达增高可以提高细胞ECAR,在先后加入寡霉素和FCCP解偶联剂后,肿瘤细胞的细胞外酸化率首先出现小幅度降低,然后大幅回升。接着我们通过MTT方法连续检测含糖或无糖条件下EZH2对胶质瘤细胞生长的影响,结果显示,在含糖条件培养下,EZH2的表达增高可以使肿瘤细胞增殖活性明显升高,而无糖条件培养下,高表达EZH2的肿瘤细胞增长速度明显慢于对照组细胞。这些结果表明,EZH2可以促使胶质母细胞瘤代谢从线粒体有氧呼吸向糖酵解转变。接下来我们构建转染 pJAX-SC,pJAX-EZH2,pJAX-EZH2+HIF1α-shRNA的三种U251细胞系,并通过显微定位技术将三种细胞系分别注射进三组随机分配的裸鼠脑中。培养32天后,通过HE染色技术处理三组载瘤裸鼠脑组织,并测量种植瘤体积。继续饲养剩余小鼠直至死亡,同时统计剩余小鼠各个时期的存活数量,绘制三组小鼠的生存曲线。实验结果显示,EZH2表达增高可以使肿瘤体积增大,同时明显缩短载瘤裸鼠的生存期。如果同时抑制代谢关键分子HIF1α的表达,可以一定程度上缩小肿瘤体积,并且延长载瘤裸鼠的生存期。利用qRT-PCR检测裸鼠颅内肿瘤中三种糖酵解酶HK2,PKM2和PFK1的表达,显示EZH2表达升高可以使肿瘤细胞中三种酶的表达显著增高。我们通过液相色谱-质谱法来检测不同EZH2表达水平裸鼠胶质瘤中代谢相关产物的变化,发现EZH2高表达的肿瘤组织中糖酵解中间产物比对照组明显增高,而三羧酸循环过程中的产物却没有显著变化。这些结果证实EZH2与颅内异种移植胶质瘤的代谢重塑相关。二、EZH2如何通过EAF2-HIF1α信号途径来影响糖酵解过程进而导致肿瘤发生和恶变缺氧诱导因子(HIF-1)是机体在缺氧环境中生成的一种具有调控基因转录的缺氧应答因子,有研究表明,HIF-1α参与了低氧环境中胶质瘤的进展过程。通过荧光素酶报告基因方法检测U251和T98G细胞中EZH2对于HIF1α转录活性的调控作用。我们将下列三种成分共转染到U251和T98G两种细胞中:pGL2-HIF1α;EZH2-shRNA 或者 SC-shRNA 或者 pJAX-SC 或者pJAX-EZH2;内参pSV-Renilla,通过荧光测定仪测定荧光素酶氧化过程中释放的生物荧光。通过与内参荧光强度进行对比,显示细胞中EZH2表达增高后,HIFlα的转录活性升高,而当敲除EZH2后,HIF1α的转录活性降低。同时,Western Blot检测结果表明,U251和T98G中过表达EZH2,HIF1α蛋白水平升高。接下来我们将不同EZH2表达水平的U251细胞进行核浆分离,Western Blot结果显示,EZH2高表达的肿瘤细胞胞核中HIF1α蛋白表达明显升高。免疫组织化学技术和Western Blot对不同EZH2表达水平的裸鼠颅内胶质瘤中HIF1α含量检测结果显示,EZH2高表达的肿瘤组织中HIF1α含量也相应升高。我们将低表达或正常表达HIF1α的U251和T98G细胞分别转染pJAX-SC或pJAX-EZH2,然后分别检测不同组细胞糖酵解酶HK2,PKM2和PFK1活性,以及脱氧葡萄糖的摄取和乳酸的产量,结果显示,胶质瘤细胞HIF1α表达被沉默之后,无论是否正常表达EZH2,细胞的糖酵解酶(HK2、PKM2、PFK1)活性以及脱氧葡萄糖摄取量、乳酸生成量都受到抑制。这些实验结果证明,EZH2通过HIF1α来介导胶质母细胞瘤的代谢重塑。我们前期预实验CHIP发现EZH2介导的H3K27并不能和HIF的启动子区域结合,而有研究显示,EAF2可以与肿瘤抑制蛋白pVHL相结合,从而中断了 HIF-1α介导的缺氧信号通路。我们通过免疫组织化学方法检测了 105例胶质母细胞瘤标本及12例正常脑组织标本中EZH2和EAF2表达含量。然后运用线性回归分析的方法得出EZH2和EAF2含量的关系,我们发现有77%的胶质瘤标本中EZH2呈现高表达,而EAF2在69%的胶质瘤标本中表达降低。根据线性回归分析可以得出,两者的表达成显著负相关。我们将U251和T98G细胞均分别转染EZH2-shRNA和pJAX-EZH2,通过Western B1ot方法检测HIF1α和EAF2表达水平,紧接着我们将胶质瘤细胞共转染EZH2-shRNA和EAF2-shRNA,然后检测HIF1α的表达水平。结果过表达EZH2既可以使胶质瘤细胞HIF1α表达升高,也可以抑制EAF2的表达,而当EZH2表达被沉默后则得出相反的结果。当细胞共同转染EZH2和EAF2的shRNA后,HIF1α的表达水平可以因EAF2抑制而出现部分逆转。同时,利用Western Blot检测了 EZH2在过表达时两种甲基化转移酶H3K27me3、H3K9me3在肿瘤细胞中的表达水平,结果显示,随着细胞中EZH2表达的升高,H3K27me3含量也明显增加,而H3K9me3含量却无明显变化。最后,通过免疫共沉淀技术来了解EZH2和H3K27me3与EAF2启动子区域的相互作用。实验结果显示,EZH2可以直接与EAF2启动子相结合,H3K27me3表观遗传学标志存在于EAF2基因组位点上。本研究表明,EZH2可以促使胶质母细胞从有氧呼吸向糖酵解代谢途径转变,从而极大的提高细胞糖酵解代谢水平。其具体机制是部分是通过EAF2-HIF1α信号转导途径激活肿瘤糖酵解过程进而导致肿瘤的发生和恶变。第二部分:HMGA1与胶质母细胞瘤复发及预后的关系研究纳入研究的25名患者原发和复发胶质母细胞瘤,经两名病理学专家重新评估,诊断准确有效,年龄和性别的差异均无统计学意义。平均无进展生存期为9.8个月。通过免疫组化的方法对原发和复发胶质母细胞瘤标本中的HMGA1的表达水平检测显示,复发胶质母细胞瘤标本中的HMGA1的表达水平高于原发组。复发胶质母细胞瘤中辅助治疗手段和HMGA1表达水平之间无显著相关性。通过免疫组化对IDH-1R132H位点突变情况进行检测,发现原发组中,HMGA1表达和IDH-1R132H位点突变之间未见显著相关性。统计学分析发现,高表达HMGA1的原发胶质母细胞瘤患者的中位无进展生存期低于低表达(未表达)组;IDH-1R132H位点突变患者与无IDH-1R132H位点突变患者的无进展生存期未见显著差异;肿瘤部分切除患者和肿瘤肉眼全切患者的无进展生存期无显著差异。本研究发现,复发的胶质母细胞瘤比起原发肿瘤HMGA1表达水平更高。HMGA1的表达水平越高,患者无进展生存期越短。