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目的肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内第五大常见的恶性肿瘤,是肿瘤相关性死亡的第三大病因。病因复杂,其中感染或自身免疫性疾病等因素导致的慢性炎症持续存在,在肿瘤的产生、发展和预后中发挥重要作用,并影响机体的免疫监控和对治疗的应答;人体的大多数肿瘤都依赖免疫细胞并可以通过免疫细胞获益,从而调整免疫细胞使之处于免疫耐受或免疫缺陷状态,使得肿瘤细胞能够逃避机体的免疫监控,从而导致疾病进展。因而,探讨HCC免疫逃逸的发生机制将会为肿瘤发生、发展以及治疗提供重要的理论基础和治疗新思路。在HCC肿瘤微环境中,发现多种免疫抑制通路被激活,其中免疫细胞及相关的细胞因子起到了关键作用。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)是一类具有独特免疫调节功能的T淋巴细胞亚群,既往研究显示Treg细胞在多种恶性肿瘤癌组织中比例增加,并且在HCC患者瘤内的高表达常与疾病的进展及预后不佳有关。但目前在肿瘤微环境中Treg为什么以及如何被趋化,其机制目前仍不完全清楚,需要进一步探究。HCC肿瘤微环境表达多种细胞因子,其中趋化因子CC家族中的CCL22及表达在Treg细胞上的高亲和力受体CCR4在Treg的迁移运动中起到重要作用,我们设想在HCC微环境内通过CCL22与其受体CCR4的结合趋化Treg细胞的迁移运动,从而引起肿瘤在肝癌局部免疫逃逸导致肿瘤的发生。本实验通过检测肝癌组织、癌旁组织标本中CCL22的表达,以及CCL22的高亲和力受体CCR4在肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)、外周血单个核细胞(perpheral blood mononuclear cell,PBMC)中Treg细胞表面CCR4受体的表达,研究CCL22/CCR4信号通路招募Treg细胞并在肿瘤部位发生免疫逃逸的作用机制。方法首先使用生物信息学,在CBioportal数据库下载HCC患者癌组织内目标基因CCL22/CCR4/CD4芯片信息,分析之间相关性,以及趋化因子及其受体的表达在数据库中的信息。收集郑州大学第一附属医院肝癌患者肿瘤组织,癌旁组织及外周血,所入组患者肝组织经病理学资料证实均为原发性肝细胞癌。提取肝癌及癌旁组织内的RNA,反转录为c DNA,采用real-time PCR技术检测趋化因子配体CCL22在肝癌组织和癌旁组织的表达,以及CD4+T细胞表面标志胞内因子Foxp3及功能因子IL-10在基因水平的表达。应用免疫组化技术检测HCC患者癌组织CCL22表达与临床参数的关系。应用密度梯度方法,提取外周血PBMC和肿瘤TIL细胞,应用流式细胞仪对T细胞亚群及趋化因子相应高亲和力受体进行检测。结果1.分析数据库芯片信息提示HCC患者癌组织内CCR4基因与CCL22及CD4存在相关性(r=0.2 p<0.0001,r=0.2 p<0.0001)。2.RT-PCR结果显示趋化因子CCL22在肝细胞癌组织中的表达高于癌旁组织(0.56±0.06 vs 0.31±0.04),差异有统计学意义。3.免疫组化检测趋化因子CCL22在HCC TNM分期I-III的表达,结果显示CCL22在TNM II表达较TNM I高(4.231±0.2571 VS 3.326±0.3671,P=0.04),差异有统计学意义;TNM III表达较TNM I高(5.100±0.4033 VS 3.326±0.3671,p=0.0048),差异有统计学意义;TNM III较TNM II无差异(5.100±0.4033 VS4.231±0.2571 p=0.0769)。通过Log-rank检验分析高表达CCL22的患者和低表达CCL22的患者相比中位生存期分别为44个月,53个月,差异具有统计学意义(p=0.01)。CCL22表达高低在年龄,性别,HBe Ag,ALT,AST,AFP中差异无统计学意义(p>0.05),而在肿瘤TNM分期(p=0.005),肿瘤大小(p=0.002),肿瘤数目(p=0.038),癌细胞分化(p=0.031)中存在统计学差异。因此CCL22可能成为预测HCC进展,预后的潜在预测指标。4.相关性分析结果显示,HCC患者的癌组织中,CCL22与Foxp3、CD4、IL10的表达均呈现不同程度的正相关(r=0.22,p<0.0001;r=0.24,p<0.0001;r=0.36,p<0.0001)。5.流式结果显示,总CD4+T细胞在TIL中的比例较PBMC中升高(35.52±2.064 VS 29.41±1.96,p=0.03),Treg细胞亚群TIL中的比例16.60±1.29较PBMC中升高9.58±1.18,p=0.0001,CCR4+Treg细胞TIL中的比例亦较PBMC中升高(40.82±2.251 vs 33.85±2.291,p=0.03),差异有统计学差异。结论1.肝癌患者肝脏组织内高表达CCL22,通过CCL22与受体CCR4结合,招募CD4+Foxp3+T(Treg)细胞向肿瘤部位聚集,引起肿瘤发生局部免疫逃逸,进而导致肿瘤发生及疾病进展。2.CCL22-CCR4信号通路可能成为HCC患者疾病发生的重要影响因素,Treg细胞参与了HCC患者肝癌的发生,该免疫学发病机制可成为予以HCC肝癌免疫治疗的新靶点。