背景:哺乳动物的卵泡是卵巢的基本功能单位,卵泡的正常发育是获得能够正常受精的卵母细胞的基础。哺乳动物的卵泡被颗粒细胞包围,颗粒细胞在卵泡发育的不同阶段受到不同激素和细胞因子的影响,发生增殖分化和凋亡,进而调节卵泡发育和卵母细胞的成熟。颗粒细胞的正常功能与卵母细胞质量和卵巢的功能紧密相关,颗粒细胞的功能障碍与一些卵巢卵泡发育异常的相关疾病有关。颗粒细胞和卵母细胞可以通过相互作用调控卵泡的发育过程,颗粒细胞可通过分泌一些细胞因子影响卵母细胞质量,当颗粒细胞受到氧化应激损伤时会引起卵子质量的下降;颗粒细胞凋亡增多也会导致卵母细胞闭锁。随着女性年龄的增长,女性生殖系统的衰老或是因为某些病理性因素导致卵巢内的卵泡生长发育异常,卵泡数量和卵母细胞质量的下降,进而会造成引发月经周期不规则甚至绝经,使卵巢功能丧失,卵巢功能的异常或者退化,导致不孕不育和其它一些女性相关疾病的发生。卵泡发育异常和雌激素分泌紊乱同样会诱发女性相关疾病,甚至影响女性生育。如今,随着人口老龄化的增长和女性生育能力的下降,目前我们迫切需要探索更多的可以延缓女性衰老,维持卵巢正常功能的方法,以此保护女性的生育能力和提高当今妇女的生活质量。坤泰胶囊（kuntai capsule,KTC）是中国一种传统的经典中草药配方,最早记录于我国张仲景的《伤寒杂病论》一书中,其一直被广泛应用于更年期综合症的临床治疗。其主要成分包括熟黄芩、阿胶、地黄、茯苓、黄连、白芍。中医上其主要功能为安神除烦、滋阴清热,可用于绝经期前后的多种病症,其主要适应症状为失眠心烦、多梦多汗,潮热面红、头晕耳鸣、腰膝酸软等,目前已广泛应用于临床,用以改善卵巢功能衰退和更年期综合征的治疗,甚至对不孕症以及卵巢早衰等均具有不错的疗效。坤泰胶囊不仅可以缓解女性卵巢储备功能,还可以提高临床妊娠率,调节月经周期,并且该药物还可以改善女性腰部疼痛,乏力等相关临床症状。有研究也同样证实坤泰胶囊对卵巢储备和生育能力具有保护作用,并且坤泰胶囊联合激素治疗卵巢早衰比单独激素治疗更有效、更安全。使用坤泰胶囊联合常规抗生素也可以有效治疗慢性盆腔炎不孕患者,改善血清中的炎症介质水平以及体内性激素水平和卵巢储备功能,降低不孕率,并且具有良好的用药安全性。黄芩苷是从黄芩的根中提取的一种化合物,具有十分广泛的药理学作用,例如抑菌、利尿、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化应激、抗变态反应及解痉、神经保护、抑制流产保胎等,是黄芩中十分重要的黄酮类化合物。然而,目前有关黄芩苷在卵巢卵泡发育中的影响及其具体作用机制研究相对有限,仍然不是十分清楚。本研究首先通过体外培养的人原代颗粒细胞和KGN细胞系探索出不同浓度的黄芩苷对体外培养的颗粒细胞的作用,结果发现在低浓度黄芩苷（如10μM和20 μM）处理下有利于人原代颗粒细胞和KGN细胞系的体外培养,超过50μM时则具有毒性作用,在此基础上,我们继续利用原代颗粒细胞和CD-1小鼠做了进一步的研究和验证。目的:利用从卵泡液中收集的人原代颗粒细胞,同时使用KGN细胞系,通过逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）,蛋白质印迹（western blotting）、流式细胞术（flow cytometry）和激素检测分析等实验技术来评估黄芩苷处理后细胞的增殖、凋亡、激素、自噬等相关因子水平的表达变化和抗氧化应激能力,探索黄芩苷对体外培养的人原代颗粒细胞生长状态和功能的影响和作用。使用mTOR信号通路抑制剂和激动剂,启动或抑制自噬相关基因,探讨凋亡与自噬之间的相互作用最后通过动物实验研究黄芩苷对CD-1老龄雌性小鼠的动情周期的影响,并且同时取黄芩苷处理后的老龄雌性小鼠卵巢进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）和免疫组化分析（immunohistochemistry,IHC）等技术进行验证,通过以上多种实验最终证实黄芩苷对女性卵巢功能、卵泡发育等方面的影响和作用机制。方法:1.实验分组:将细胞实验分为阴性对照（negative control,NC）组和黄芩苷处理（Baicalin）组;使用不同浓度的黄芩苷分别处理细胞,确定适当的处理浓度。2.研究黄芩苷对于体外培养的人原代颗粒细胞增殖和凋亡功能的影响:通过一定浓度的黄芩苷处理后与其相对应的阴性对照组细胞,采用CCK8检测法检测黄芩苷对人原代颗粒细胞活力的影响;随后利用qRT-PCR、Western blotting等实验技术,分别探索Bax、Bcl-2、Caspase 3在两组细胞中的表达水平。3.研究黄芩苷处理后对过氧化氢诱导的人原代颗粒细胞氧化应激损伤的影响:构建过氧化氢诱导的氧化应激损伤细胞模型,经黄芩苷处理后采用流式细胞学分析技术分析黄芩苷对过氧化氢引诱导的颗粒细胞凋亡损伤的作用。4.研究黄芩苷处理后对人原代颗粒细胞内类固醇激素水平的影响:通过一定浓度的黄芩苷处理后与相对应的阴性实验组细胞,采用qRT-PCR实验技术探索P450Aromatase和StAR在两组中的表达水平,采用化学发光免疫分析法检测雌二醇和孕酮浓度。5.研究黄芩苷对老龄雌性小鼠的动情周期和卵巢卵泡发育的影响:对老龄雌性小鼠进行黄芩苷灌胃后行小鼠阴道细胞涂片检测,卵巢苏木精-伊红染色,促排卵后收集卵母细胞进行体外长时培养,观察老龄雌性老龄小鼠的动情周期变化、卵泡发育情况。6.探索黄芩苷是否通过mTOR信号通路参与对人原代颗粒细胞和老龄雌性小鼠卵巢功能的调控:使用mTOR激活剂（MHY1485）和mTOR抑制剂（HY-112914）处理细胞后,利用qRT-PCR、流式细胞学分析技术等研究细胞自噬对细胞凋亡的影响和作用;同时取灌胃后的老龄雌性小鼠的卵巢切片后进行免疫组化实验分析,探索p-mTOR在雌性小鼠中的表达。结果:1.黄芩苷对体外培养的KGN细胞系和人原代颗粒细胞具有剂量依赖性作用;低浓度的黄芩苷处理有利于维持体外培养的KGN细胞和人原代颗粒细胞的生长状态;当黄芩苷浓度超出一定浓度时会对细胞产生一定的毒性作用。2.黄芩苷处理体外培养的细胞后,KGN细胞和原代颗粒细胞的细胞活力显著高于对照组;黄芩苷上调了Bcl-2蛋白表达水平,下调了Bax和Caspase 3蛋白表达水平;黄芩苷上调了Bcl-2 mRNA表达水平,下调Bax mRNA和Caspase 3 mRNA表达水平;黄芩苷可以降低人原代颗粒细胞的凋亡率。3.通过构建过氧化氢诱导的细胞氧化应激损伤模型,最后采用流式细胞术检验,实验结果显示,黄芩苷能显著抑制过氧化氢诱导的体外培养的人原代颗粒细胞的凋亡,显著降低了原代颗粒细胞的凋亡率。4.黄芩苷预处理后可以显著提高体外培养的人原代颗粒细胞P450arom mRNA和StAR mRNA表达水平,而P450arom和StAR与甾体激素的产生密切相关;同时检测出黄芩苷处理组的雌二醇、孕酮水平显著高于对照组。5.对CD-1雌性老龄小鼠隔日灌胃黄芩苷100 mg/kg,对照组给予同等剂量的生理盐水隔日灌胃,灌胃60天后相关实验结果显示:与对照组相比,黄芩苷处理组的小鼠动情时间增加,动情间隔期缩短;黄芩苷处理组的老龄雌性小鼠卵巢中各个阶段的卵泡数量增多;老龄对照组的卵母细胞退变率要显著高于黄芩苷处理组。6.取灌胃后的老龄雌性小鼠的卵巢切片后进行免疫组化实验分析,结果显示,p-mTOR在雌性小鼠的卵泡发育的各个阶段的颗粒细胞和卵母细胞的胞浆中均有表达,其中在卵母细胞中的表达较强;qRT-PCR检测实验结果显示,黄芩苷可显著降低体外培养的人原代颗粒细胞中mTOR mRNA的表达水平;流式细胞凋亡检测实验结果显示,MHY1485可以显著抑制人原代颗粒细胞的活力,而黄芩苷则可以显著逆转MHY1485的抑制作用,显著提高人原代颗粒细胞的活力;HY-112914处理可以显著提高体外培养的人原代颗粒细胞的活力。结论:1.黄芩苷对体外培养的颗粒细胞具有剂量依赖性作用,可显著提高颗粒细胞活力,抑制细胞凋亡,并且可以逆转过氧化氢引起的细胞损伤和凋亡;2.黄芩苷促进细胞内类固醇激素的生成;3.mTOR信号通路通过调控颗粒细胞功能进而影响和改善卵巢和卵泡的发育;