论文部分内容阅读
目的:据世界卫生组织统计,在1975年至2016年期间,全世界的肥胖率几乎增加了两倍,同时伴随着肥胖妇女不孕率和流产风险的显著增加。在妊娠早期,胚胎着床后子宫内膜发生蜕膜样改变(小鼠孕D5天囊胚粘附并侵入子宫内膜,子宫内膜基质细胞随即广泛地增殖和分化,发生蜕膜化样改变,孕D6、D7天形成蜕膜区)。这一过程是确保胎盘正常形成的重要基础,在胎盘形成以前担负着保护和营养胚胎的重要作用,对妊娠的建立和维持至关重要。尽管目前的研究发现肥胖可能与子宫内膜蜕膜化损伤有关,但是肥胖是否导致孕期子宫内膜基质细胞蜕膜化异常及其具体机制尚不明确。因此,本课题拟通过一系列动物和细胞模型,探讨高脂饮食所诱导的母体孕前肥胖是否可引起子宫内膜蜕膜化异常,并进一步从脂代谢的角度探究其可能机制。方法:1.实验模型的构建及材料收集:1)高脂肥胖小鼠模型的建立:4周龄C57BL/6J雌鼠喂养高脂饲料(60%kcal)/对照饲料(10%kcal)12周,每周记录小鼠体重数据。绘制12周体重增长曲线,双能X射线吸收法检测小鼠体脂成分,全自动生化分析仪检测小鼠空腹血甘油三酯(TG)和总胆固醇的水平,ELISA检测小鼠空腹胰岛素的含量,检测小鼠葡萄糖耐量(GTT)并统计曲线下面积。通过这些检测验证高脂肥胖小鼠模型是否构建成功。2)正常妊娠小鼠模型的建立:将高脂鼠/对照鼠与正常雄性C57BL/6J小鼠合笼交配,次日早上检查阴栓,出现阴栓记为妊娠第1天(D1),收集蜕膜化关键时期(D5-D7)的子宫组织进行检测。3)假孕小鼠人工诱导蜕膜化模型的建立:将高脂鼠/对照鼠与输精管结扎雄性C57BL/6J小鼠合笼交配,次日早上检查阴栓,出现阴栓记为假孕第1天(PD1),于PD4将一侧子宫角注射玉米油进行小鼠体内人工诱导子宫内膜蜕膜化,对侧子宫角不作处理设为对照,收集小鼠假孕第八天(PD8)人工诱导蜕膜化的子宫组织用于后续研究。4)小鼠子宫内膜基质细胞(m ESCs)体外人工诱导蜕膜化模型的建立:分离原代小鼠子宫内膜基质细胞,在细胞培养过程中采用雌、孕激素处理诱导蜕膜化,高脂组采用油酸(OA)和棕榈酸(PA)联合处理细胞。通过鬼笔环肽染色观察蜕膜细胞形态,Western blot检测蜕膜相关蛋白BMP2等的表达。2.高脂肥胖对小鼠子宫内膜蜕膜化的影响:1)统计并分析高脂/对照小鼠孕D5-D7子宫胚胎着床点的数量,采用HE染色观察孕鼠D7的子宫内膜细胞的形态,Western blot检测孕鼠D7子宫内膜MMP2、BMP2、PR等蜕膜化相关蛋白的表达。2)称量两组假孕小鼠蜕膜化诱导侧/非诱导侧的子宫重量,Western blot检测蜕膜化相关蛋白的表达。3)鬼笔环肽染色观察小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化诱导后的细胞形态,Western blot检测蜕膜化相关蛋白的表达。3.高脂肥胖对小鼠子宫内膜线粒体功能的影响:透射电镜(TEM)技术观察高脂/对照孕鼠D6的子宫内膜线粒体形态,气相色谱质谱仪(GC-MS)检测孕鼠D7子宫内膜组织的ATP含量,RT-PCR检测高脂孕鼠D7天子宫内膜组织的氧化磷酸化相关基因的表达水平。Mitotracker检测蜕膜化诱导后的m ESCs细胞的细胞膜电位。4.高脂肥胖对小鼠子宫内膜脂质代谢的影响:1)油红O、透射电镜和GC-MS分别检测孕鼠D6-D7子宫内膜中脂滴沉积和各中长链脂肪酸的含量,甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)检测试剂盒测定孕鼠D7子宫内膜组织的TG和MDA含量,Western blot、RT-PCR检测脂质代谢相关蛋白和基因的表达。2)油红O检测蜕膜化诱导后的m ESCs细胞中的脂滴沉积情况,TG/MDA检测试剂盒检测细胞中TG和MDA的含量,Western blot检测脂质代谢相关蛋白的表达。在高脂处理的细胞中加入CPT1A抑制剂Etomoxir,BODIPY探针检测m ESCs蜕膜化诱导后的脂滴沉积情况,Western blot检测蜕膜化诱导后m ESCs的脂质代谢和蜕膜化相关蛋白的表达。5.高脂肥胖对孕鼠胎儿和胎盘发育的影响:观察孕鼠D12的胎儿和胎盘发育情况,并称取重量。结果:1.高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型构建成功:高脂组小鼠体重和体脂比显著升高,空腹血清胰岛素、TG、总胆固醇水平明显增加,GTT显著降低。2.高脂饮食诱导的肥胖小鼠早孕子宫内膜蜕膜化受损:高脂饮食导致正常妊娠小鼠孕D5-D7着床胚胎数量显著减少。假孕鼠人工诱导蜕膜化侧子宫重量明显减轻。鬼笔环肽染色显示高脂组原代基质细胞诱导蜕膜化受损。正常妊娠模型、人工诱导蜕膜化模型和m ESCs体外蜕膜化诱导模型的Western blot检测结果均显示高脂组蜕膜化标志分子BMP2、MMP2、PCNA等表达显著降低。孕鼠D7天子宫HE染色显示高脂肥胖导致子宫蜕膜细胞形态异常。3.高脂饮食诱导的肥胖小鼠子宫内膜线粒体功能受损:TEM检测显示高脂孕鼠D6天子宫内膜的线粒体明显肿胀。GC-MS检测发现高脂肥胖孕鼠D7天子宫蜕膜组织ATP水平显著升高。Mitotracker检测结果提示高脂组m ESCs细胞蜕膜化诱导后线粒体跨膜电位显著降低。RT-PCR检测显示高脂孕鼠D7天子宫内膜组织Ndufb6、Atp5b等氧化磷酸化标志分子表达明显升高。4.早孕小鼠子宫蜕膜化过程中,高脂饮食诱导的肥胖小鼠子宫内膜脂代谢紊乱:与对照小鼠相比较,油红O、TG定量检测和TEM检测结果均显示高脂饮食诱导的肥胖小鼠子宫内膜中脂滴聚集明显,高脂组m ESCs细胞体外蜕膜化诱导后油红O和BODIPY探针染色结果与之一致。GC-MS检测显示高脂孕鼠D6天子宫内膜中长链脂肪酸的含量发生改变。Western blot和RT-PCR结果显示脂代谢重要分子CPT1A(脂肪酸氧化)、FAS(脂肪酸合成)等表达显著升高。体外细胞模型Western blot结果显示,CPT1A抑制剂Etomoxir干预后可显著降低高脂干预组细胞中脂质代谢相关分子的表达,且使其原本损伤的蜕膜化得到一定程度的改善。5.高脂饮食诱导的肥胖孕鼠胎儿发育不良:统计结果显示,高脂饮食诱导的肥胖孕鼠D12的胎儿和胎盘体积均明显减小、重量显著降低。结论:高脂饮食诱导的肥胖孕鼠子宫内膜蜕膜化异常,其可能和子宫内膜脂代谢紊乱有关。