随着生物产业的快速发展，下游分离技术逐渐成为生物制品生产的瓶颈。作为具有良好特异性的分离技术之一，亲和色谱已在多种蛋白制品，特别是在抗体的分离中取得成功。其中以染料分子为配基，特别是以三嗪基染料分子为仿生配基的亲和色谱已成为该领域的研究热点之一。尽管越来越多的三嗪基染料分子作为亲和配基在蛋白色谱应用中取得成功，但是对于这类配基分子的研究主要集中在新型色谱介质的制备和色谱方法的建立方面，而对于它们与目标蛋白质之间的相互作用的研究较少，这极大地限制了三嗪基染料配基的进一步应用以及新型配基分子的设计。
　　因此，为了明确三嗪基染料配基与蛋白质之间相互作用的分子机制，本研究基于前期筛选结果，选择三嗪基染料分子Reactive Blue4（RB-4）作为亲和配基，通过光谱学手段研究了RB-4与蛋白质之间的相互作用，并通过RB-4官能化的琼脂糖凝胶介质进一步确定了RB-4对蛋白质的吸附过程，为以RB-4作为亲和配基的亲和色谱方法提供了理论支持。本研究获得以下主要结论：
　　（1）通过紫外吸收光谱和内源荧光光谱证明RB-4与牛血清白蛋白（BSA）以及菠萝蛋白酶通过静态猝灭机制形成稳定复合物，该结合过程是自发、放热过程，低温有利于两者之间的结合；RB-4与BSA和菠萝蛋白酶之间的结合位点数分别为约2和约1，结合位点数随环境条件变化不大，表明RB-4与BSA和菠萝蛋白酶之间具有较强的相互作用；KA随pH值的变化规律与蛋白质的等电点有关，初步判断RB-4与蛋白质的相互作用以疏水相互作用为主，且能够与带正电荷的蛋白质分子发生静电相互作用；同步荧光光谱和三维荧光光谱结果表明RB-4与BSA和菠萝蛋白酶的结合导致BSA的三级结构破坏，空间结构变得松散，从而使酪氨酸残基和色氨酸残基周围微环境的疏水性增强。通过RB-4与BSA分子对接实验进一步表明RB-4与BSA之间的主要作用力类型为疏水相互作用（主要作用氨基酸位点为Phe-567、Ala-568、Ala-510、Val-575、Pro-572和Phe-508），同时还存在一定的静电作用与氢键作用。
　　（2）通过静态吸附实验表明两种RB-4官能化的色谱介质：常规亲和色谱介质RB-4-Sepharose4B和接枝型亲和色谱介质RB-4-Dextran-Sepharose4B对BSA的吸附过程是放热反应，高温不利于吸附；吸附过程符合Langmiur模型，主要作用力为疏水相互作用；通过提高配基密度，可以显著提高介质对BSA的吸附量；在相同条件下，接枝型亲和色谱介质RB-4-Dextran-Sepharose4B的吸附量优于常规亲和色谱介质RB-4-Sepharose4B；吸附动力学实验表明RB-4-Sepharose4B和RB-4-Dextran-Sepharose4B两者对BSA的吸附速率均较快，但接枝型亲和色谱介质RB-4-Dextran-Sepharose4B的吸附速率相对更快。