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目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）,又称冠心病,是全球威胁人类生命健康及生活质量的重要原因之一,是中低收入国家中慢性非传染性疾病死亡的首要原因。CHD发生的主要病理基础是动脉粥样硬化（AS）,即由脂质驱动,内皮细胞、平滑肌细胞和白细胞参与形成粥样斑块的慢性病理性过程。其中,血管平滑肌细胞（VSMCs）参与泡沫细胞和细胞外基质合成的主要部分。由于动脉血管壁增厚、粥样斑块生成,血管管腔狭窄后血液流速减慢、流量减少,因此血流覆盖区域心肌组织营养物质供应不足并导致心脏功能改变。CHD的危险因素有很多,其中危险系数日益扩大的一种因素是糖尿病（DM）,被专家称为CHD的“等危症”。数据显示,全球DM人数正在大幅增加,其导致的死亡率也在逐年升高。DM人群中CHD的发病呈现隐匿性高、发病率高、起病更早、发展迅猛、致残致死率更高的特点。糖基化终末产物（AGEs）是一种存在于所有生物体内的非酶糖基化产物,可来源于体内生成和体外饮食摄入。当体内AGEs积累量超过代谢水平时会影响胰岛素分泌功能引起机体出现氧化应激、炎症反应和内皮损伤等,进一步导致糖尿病及其并发症,包括糖尿病性动脉粥样硬化的发生。HO-1是维持细胞和机体稳态的一种重要的抗氧化因子,同时可以起到抗炎、抗压、抗凋亡、抗衰老等作用。HO-1可被多种细胞因子、物理或化学因素刺激并被多种Micro RNA直接或间接调控参与不同的信号通路中,因此,HO-1在多种生长发育和疾病发展中均发挥重要作用。研究已知,HO-1对可以保护心肌组织,改善内皮结构,恢复心脏功能和血流灌注,抵抗外界刺激对心血管系统的损伤。WWP2是一种HECT型E3泛素连接酶,在全身多个器官中均有表达,参与多种细胞生理和病理过程。WWP2主要通过泛素-蛋白酶体途径降解底物蛋白调节疾病的发生进展,还可以通过单泛素化反向激活细胞因子调节细胞分化和蛋白质翻译后修饰。目前,WWP2已被证实在肿瘤等细胞、骨和软骨等组织中承担多种功能。在心血管疾病中,WWP2通过TGFβ/SMAD2和泛素化降解PARP1参与调节心肌纤维化重塑,通过调控STAT3去乙酰化促进高血压血管病变,在心律失常初期受PPP1R3A调控起到保护作用。但是,WWP2在糖尿病动脉粥样硬化病变及作用机制中无相关研究结果,HO-1是否可作为WWP2的底物蛋白之一参与调节细胞功能状态也无文献支持。本研究通过动物模型和细胞模型明确WWP2对糖尿病诱导的动脉粥样硬化和AGEs诱导的血管平滑肌细胞增殖迁移的作用及其可能的作用机制。研究方法:1.明确不同浓度中AGEs对VSMCs中WWP2和HO-1表达变化。将细胞分为4组分别加入不同体积AGEs溶液使浓度分别为0、5、10、15ng/ml,通过western blot实验检测WWP2和HO-1蛋白表达水平。2.明确过表达WWP2对VSMCs增殖迁移的影响。将细胞分为HA-Control+BSA组、HA-Control+AGEs组、HA-WWP2+BSA组、HA-WWP2+AGEs组共4组,通过CCK-8实验、Transwell实验、鬼笔环肽染色实验检测VSMCs活性和增殖迁移能力,并通过western blot实验检测增殖迁移相关指标和HO-1蛋白表达水平。3.明确敲减WWP2对VSMCs增殖迁移的影响。将细胞分为Si-Control+BSA组、Si-Control+AGEs组、Si-WWP2+BSA组、Si-WWP2+AGEs组共4组,通过CCK-8实验、Transwell实验、鬼笔环肽染色实验检测VSMCs活性和增殖迁移能力,并通过western blot实验检测增殖迁移相关指标和HO-1蛋白表达水平。4.明确WWP2和HO-1在VSMCs中的相互作用关系及AGEs和MG132对相互作用的影响。将细胞分为WWP2（HO-1）组和对照组共2组,通过免疫共沉淀实验检测HO-1（WWP2）的表达水平;之后将细胞分为空白对照、AGEs（MG132）组、Ig G对照组共3组,通过免疫共沉淀实验检测WWP2蛋白表达水平。5.明确WWP2对HO-1表达水平的影响。将细胞分为4组分别转染0、2、4、6μg HA-WWP2,通过western blot实验检测HO-1蛋白表达水平。6.明确MG132和CHX对WWP2调控HO-1表达水平的影响。先将细胞分为HA-Control+MG132（CHX）0小时组、HA-Control+MG132（CHX）3小时组、HA-Control+MG132（CHX）6小时组、HA-WWP2+MG132（CHX）0小时组、HA-WWP2+MG132（CHX）3小时组、HA-WWP2+MG132（CHX）6小时组共6组,通过western blot实验检测HO-1表达水平;后将细胞分为Si-Control+MG132（CHX）0小时组、Si-Control+MG132（CHX）3小时组、Si-Control+MG132（CHX）6小时组、Si-WWP2+MG132（CHX）0小时组、Si-WWP2+MG132（CHX）3小时组、Si-WWP2+MG132（CHX）6小时组共6组,通过western blot实验检测HO-1表达水平。7.明确WWP2对HO-1泛素化的影响。先将细胞分为HA-Control组、HA-WWP2组、Ig G对照组共3组,其中HA-Control组、HA-WWP2组共转染HA-Ub,通过免疫共沉淀实验检测HO-1和HA表达水平;后将细胞分为Si-Control组、Si-WWP2组、Ig G对照组共3组,其中Si-Control组、Si-WWP2组共转染HA-Ub,通过免疫共沉淀实验检测HO-1和HA表达水平。8.构建SM22αCre;WWP2FL/FL小鼠队列,腹腔链脲佐菌素（STZ）诱导小鼠糖尿病模型并持续监测血糖及体重情况。9.明确WWP2对高血糖刺激的小鼠动脉粥样硬化的影响。将小鼠分成SM22αCre-;WWP2FL/FL+SSC组、SM22αCre-;WWP2FL/FL+STZ组、SM22αCre+;WWP2FL/FL+SSC组、SM22αCre+;WWP2FL/FL+STZ组共4组,通过腹主动脉超声和主动脉组织H＆E染色检测小鼠动脉血管壁厚度,通过主动脉组织Masson染色检测小鼠动脉血管纤维化程度,通过western blot实验检测小鼠主动脉血管组织增殖迁移相关指标和HO-1蛋白表达水平。结果:1.在VSMCs中随着AGEs加药浓度的增加,WWP2表达水平也逐渐升高,而HO-1的表达水平逐渐下降,于AGEs浓度为15ng/ml时变化最为明显。2.与空载组相比,过表达WWP2促进了VSMCs增殖活力和迁移能力,使细胞骨架更加紊乱,并且增殖迁移蛋白表达水平升高而HO-1蛋白表达水平下降,同时过表达WWP2扩大了AGEs对VSMCs增殖迁移的影响。3.与空载组相比,敲减WWP2抑制了VSMCs增殖活力和迁移能力,使细胞骨架更加规整,并且增殖迁移蛋白表达水平降低而HO-1蛋白表达水平上升,同时敲减WWP2缩小了AGEs对VSMCs增殖迁移的影响。4.在VSMCs中WWP2和HO-1可以相互结合,加入AGEs刺激后可以增强两者间结合的能力,同时MG132也可以增强WWP2和HO-1结合的能力。5.梯度过表达WWP2后,HO-1的表达水平随着WWP2表达水平的上升而下降。6.HO-1的表达水平随着MG132加药刺激时间增加而增高,随着CHX加药刺激时间增加而降低,并且过表达或敲减WWP2会影响MG132和CHX对HO-1表达水平的作用。7.过表达WWP2后HO-1的泛素化水平增加,敲减WWP2后HO-1的泛素化水平下降。8.小鼠基因型分别为SM22α-Cre-;WWP2FL/FL和SM22α-Cre+;WWP2FL/FL,并且腹腔注射后小鼠血糖水平持续高于正常水平,体重逐渐下降。9.相比于对照组小鼠,高血糖组小鼠血管管壁厚度和纤维化程度更高,增殖迁移蛋白表达水平更高而HO-1蛋白表达水平下降,同时相较于SM22α-Cre+;WWP2FL/FL组,SM22α-Cre-;WWP2FL/FL明显缓解高血糖对于主动脉血管病变的刺激。结论:1.WWP2促进AGEs诱导的VSMCs增殖迁移并通过泛素-蛋白酶体途径降解HO-1。2.WWP2促进高血糖诱导的小鼠主动脉血管病变并导致小鼠血管中HO-1表达下降。