目的：多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种浆细胞克隆性疾病，至今尚不能治愈。近10年来，关于去甲基化药物地西他滨（decitabine，DAC）及其联合其他药物治疗MM的研究逐渐引起重视。DAC是特异的DNA甲基化转移酶抑制剂，可逆转DNA的甲基化过程，激活沉默失活的抑癌基因。我们既往的研究已证实DAC对骨髓瘤细胞株U266和RPMI8226的诱导凋亡效果。糖皮质激素在MM的治疗中具有明确疗效，可诱导MM细胞凋亡。为进一步明确DAC联合传统骨髓瘤治疗药物对MM细胞增殖抑制及促凋亡的机制，我们设计去甲基化药物（DAC）联合地塞米松（DEX）作用于骨髓瘤细胞株U266和RPMI8226的实验研究，通过检测甲基转移酶DNMT3AmRNA，P16基因mRNA表达的变化，观察其对细胞凋亡的影响，为多发性骨髓瘤新的治疗方法提供理论依据。方法：1细胞系的选择与培养实验选用与体内不同发育阶段瘤细胞的生存状态相对应的IL-6依赖细胞株U266和非IL-6依赖细胞株RPMI8226为研究对象。常规方法培养人多发性骨髓瘤细胞株U266和RPMI8226，U266细胞每72小时传代一次，RPMI8226细胞每48-72小时传代一次，选用对数生长期细胞进行试验。每组实验重复3次。2CCK-8法检测DAC、DEX单药及联合对U266和RPMI8226细胞株增殖的影响用DAC（终浓度为0.5mmol/L）、DEX（终浓度分别为0.0001mmol/L、0.001mmol/L、0.01mmol/L）及DAC联合DEX作用U266和RPMI8226细胞24h、48h、72h，观察细胞的增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。并用金正均公式计算联合用药效果是协同、相加或拮抗，计算公式为：Q=EA+B/（EA+EB-EAEB）。EA和EB为各药单用抑制率，EA+B为两药合用抑制率。0.85≤Q≤1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用，Q≤0.85为拮抗作用。3AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡DAC（终浓度为0.5mmol/L）、DEX（终浓度分别为0.0001mmol/L、0.001mmol/L、0.01mmol/L）分别或联合作用于U266和RPMI8226细胞株，观察作用24h、48h、72h的凋亡率及各期凋亡细胞的比例。4实时荧光定量PCR法（real-time RT-PCR）检测P16mRNA、DNMT3-AmRNA的表达情况收集作用48h后的各组U266和RPMI8226细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA后，RT-PCR法检测P16mRNA、DNMT3AmRNA的表达。记录各组目的基因及内参基因CT值，应用公式F=2-△△CT计算，△△CT值=（待测组目的基因CT值-待测组内参基因CT值）-（对照组目的基因CT值-对照组内参基因CT值），得到相对表达量。P16基因、DNMT3A及内对照基因引物序列：P16基因上游引物：5’-TTCCTGGACACGCTGGTGGTGC-TGC-3’；下游引物：5’-CGCGGCAT CTATGCGGGCATGGTTA-3’；片段长度：177bp。DNMT3A上游引物：5’-TATTGATGAGCGCACAAGAGAGC-3’；下游引物：5’-GGGTGTTCCAGGGTAACATTGAG-3’；片段长度：138bp。内参β-actin上游引物：5’-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3’；下游引物：5’-TGGTCCAGGGG TCTTACTCC-3’；片段长度：174bp。5统计学分析SPSS16.0软件进行分析，先做正态性分布检测，分组资料以均数±标准差表示。方差齐性检测，方差齐同，两组比较应用t检验，多组比较应用单因素方差分析；方差不齐，应用非参数检验。P＜0.05为有差异，提示有统计学意义。结果：1DAC、DEX分别及联合对U266和RPMI8226细胞株增殖抑制的影响1.1DAC单药作用U266和RPMI8226细胞DAC分别作用于U266和RPMI8226细胞24h、48h、72h后，U266细胞增殖抑制率由7.03±1.99（%）提高到52.12±3.36（%），RPMI8226细胞增殖抑制率由10.32±2.36（%）提高到68.75±4.85（%）。以时间为变量进行统计分析，DAC作用于两种细胞系均呈时间依赖性（P＜0.05）。1.2DEX单药作用U266和RPMI8226细胞DEX（终浓度分别为0.0001mmol/L、0.001mmol/L、0.01mmol/L）作用于U266和RPMI8226细胞24h、48h、72h后，分别以时间、剂量为变量，进行单因素方差分析，发现随着药物作用浓度的增加和作用时间的延长，两种细胞的增殖抑制率均有明显增高趋势（P＜0.05）。1.3DAC联合DEX作用U266和RPMI8226细胞DAC联合DEX（0.0001mmol/L、0.001mmol/L、0.01mmol/L）分别作用于U266和RPMI8226细胞24h、48h、72h后，增殖抑制率与单药组相比有统计学意义（P<0.05）。随着DEX浓度的增加和作用时间的延长，U266细胞的增殖抑制率由13.58±1.87（%）提高到79.15±2.64（%）；RPMI8226细胞的增殖抑制率由18.77±2.27（%）提高到92.30±2.26（%）；各处理组之间进行统计学分析，除DEX0.001mmol/L联合DAC组与DEX0.01mmol/L联合DAC组作用RPMI8226细胞72h无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组均有统计学意义（P<0.05）。且Q值均介于0.85-1.15之间。说明DAC与DEX联合作用U266和RPMI8226细胞，为两药作用的单纯相加。提示DAC和DEX均可增强骨髓瘤细胞U266和RPMI8226的生长抑制效应，其联合作用时效果呈现相加，且增殖抑制效果在较低浓度DEX时更显著。2DAC、DEX及两药联合对U266和RPMI8226细胞凋亡的影响AnnexinV/PI双染法检测结果显示，DAC作用U266和RPMI8226细胞24h、48h、72h后，与对照组相比，凋亡率均明显增加（P＜0.05）。U266细胞的凋亡率由11.97±3.39（%）增加到35.33±5.80（%），RPMI8226细胞的凋亡率由13.36±1.25（%）增加到41.76±1.47（%），二者均以早期凋亡为主，呈时间依赖性（P＜0.05）。DAC联合DEX作用后，与单药组相比，两种细胞的凋亡率均明显增高（P＜0.05），且均以早期凋亡为主，呈时间依赖性。在U266细胞中，凋亡率最高为75.20±1.70（%），RPMI8226细胞中最高为86.28±2.60（%）。两种细胞间进行凋亡率比较，DAC联合DEX对RPMI8226细胞的诱导凋亡作用较U266细胞明显（P＜0.05）。各药物组之间进行比较，除DEX0.001mmol/L联合DAC组与DEX0.01mmol/L联合DAC组作用U266和RPMI8226细胞72h无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组均有统计学意义（P<0.05）。结果提示两药联合增强了其促凋亡作用，促凋亡效果在较低浓度DEX时更显著。3DAC联合DEX对U266和RPMI8226细胞P16mRNA、DNMT3AmRNA表达的影响RT-PCR结果显示：DAC单药作用于U266和RPMI8226细胞48h后，分别与对照组相比，P16mRNA相对表达量均明显提高，DNMT3AmRNA相对表达量均明显减低，差异均有统计学意义（P<0.05）。提示DAC增强U266和RPMI8226细胞中P16mRNA的表达，下调DNMT3AmRNA的表达。不同浓度的DEX单药作用后，分别与对照组相比，各组间均无统计学差异（P＞0.05），提示DEX对P16mRNA和DNMT3AmRNA的表达无影响。DAC与DEX联合作用后，分别与DAC单药组相比，各组间均无统计学差异（P＞0.05），提示二者联合对DNMT3AmRNA和P16mRNA的影响较DAC单独作用无变化。结论：1DAC与DEX单独及联合均可抑制U266和RPMI8226细胞株增殖，并促进两种细胞凋亡，且均以早期凋亡为主，呈时间和剂量依赖性。DAC与DEX联合作用相加。2DAC联合DEX对非IL-6依赖的RPMI8226细胞促凋亡作用较IL-6依赖的U266细胞明显。均在较低DEX浓度时呈现联合相加作用。3DAC能降低DNMT3AmRNA的表达量，增强P16基因mRNA的表达量。DEX未显示此作用。二者联合对DNMT3AmRNA和P16mRNA影响较DAC单独作用无变化。4对于U266和RPMI8226细胞，大剂量DEX较小剂量未显示出抑制增殖和促进凋亡的优势。