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中药现代化的基础和关键在于中药材质量标准的研究,然而在中药现代化的进程中,明显出现发展不平衡现象,偏重于中药材及中成药的化学成分测定和化学结构的研究,DNA分子标记技术的面世,使中药指纹图谱的研究深入到分子及基因水平,在中药的真伪、基原、品质、质量评价方面提供了一个本质鉴别;比在形态、组织和化学水平上检测更能代表中药分析的遗传本质;它能比较全面反映中药内在成分的种类与数量,尤其是现阶段中药有效成分绝大多数没有明确的情况下,将能更好的表明中药的内在质量,大大提高中药质量评价的技术水平和科技含量。有利于中药及其产品进入国际市场,与国际接轨。
山药(RhizomaDioscoreae)为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaeoppositaThumb.的块茎,属多年生缠绕草本植物。山药是我国最大众化的传统保健食品之一,除了少数热带地区外,几乎各地都有栽培,可分山地生、平地生、也有野生的。山药集中产于河南、陕西、山东等地区;在诸多品种中,以河南的“怀山药”最负盛名,其品质优良,既是食用的佳蔬,又是入药的道地药材,为历史上著称的“四大怀药”之一。山药具有补脾养肺、生津益肺、补肾涩精的功能,主治脾虚食少、久泻不止、肺虚喘咳、肾虚遗精、带下、尿频、虚热消渴等症。
目前,道地药材多为栽培种植生产,由于种种原因,这些品种之间质量参差不齐,各品种的种质资源在形态特征、产量、质量及抗病性等方面均有较大差异,各品种间遗传背景、亲缘关系尚不清楚,传统的优良品种很难确定。长期以来的这些相关研究大多限于形态、化学、药效等方面,多停留在利用现代仪器分析技术对道地药材质量优劣进行比较和评价,很少从生物学水平上,特别是从分子生物学水平上对道地药材的形成机理进行深入的探讨。因此,为了鉴定和评价道地药材品种内性状的变异和品质差异及不同种质之间的亲缘关系,克服用传统鉴别方法不易区分品种的缺点,有必要运用分子生物学等新技术对山药种质资源遗传多样性及种内基因序列进行研究。
本课题运用分子生物学技术中的RAPD法和核糖体rDNAITS区测序技术结合高效液相色谱法及红外光谱技术,对“四大怀药”之一的山药的药材及叶片进行了科学的质量评价,其总体思路是:本课题拟找到一种将山药的宏观红外指纹图谱与微观分子、基因水平,以及化学成分含量之间的有机关系,建立新的山药质量评价体系并取得了如下研究成果:
(1)利用HPLC法测定不同产地、不同品种山药中化学指标成分尿囊素的含量并加以比较。找出含量分布的规律性,并且为今后与山药基因规律的变化相对照找出种内基因与含量多少之间的关系奠定基础。
(2)测定不同产地的山药的红外一拉曼光谱,结合化学计量学中的识别模式(主要是成分分析方法和聚类分析方法)方法,并借助计算机解析技术,建立红外指纹图谱,从宏观上快速鉴别道地山药与非道地山药。
(3)采用DNA分子遗传标记技术,对49个不同品种的山药进行了RAPD(RandomAmplifiedPolymorphismDNA随机扩增多态性DNA)分析,找出不同品种、不同产地山药的遗传多样性。并作为种内基因测序的初步筛选。
(4)利用PCR直接测序技术测定不同品种山药的nrDNAITS区基因核苷酸序列,作序列同源性分析,并对样品的扩增结果进行系统树分析,找出不同品种山药的同源性的多少。
本课题应用DNA分子遗传标记技术研究不同品种山药的DNA的遗传多样性,并对样品的扩增结果进行聚类分析,分析不同品种的山药的遗传性差异。结合PCR直接测序技术,对不同产地的山药基因进行序列研究,分析变异位点的多少来鉴别不同品种山药的差别。运用现代分析技术测定山药中化学指标成分的含量:HPLC法测定山药中尿囊素的含量。以对比遗传基因和化学成分含量之间的相互关系。另外还选取不同产地和不同品种的山药,用适当的提取方法进行提取分离或直接粉碎成粉末,进行红外光谱分析,对图谱差别加以分析论证。将不同产地的山药药材的红外指纹图谱、DNA指纹图谱加以分析比较,找出其中的相关性并结合HPLC测出的指标成分的含量,总结结果,寻找不同产地的山药从宏观到微观本质的区别,为鉴别道地药材与非道地药材提供新的理论依据。
本课题无论从研究思路上还是从方法学上,都对中药的质量标准研究具有十分重要的意义,这不仅对于山药的GAP生产和中药材质量标准化的建立有重要指导意义,而且也为其它道地药材的种内基因的差异的研究提供了一定的科学依据和科研思路,并有利于中药产业的可持续发展,为新品种的培育、种质资源的保存和利用奠定基础,同时也有利于促进中药现代化的发展。