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背景与目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因子,并且与胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关。目前治疗慢性Hp感染的常规方法是两种抗生素加质子泵抑制剂或铋剂的三联或四联疗法,但存在细菌耐药,药物不良反应,复发再感染及药效经济学等问题,因此,研制Hp疫苗是预防和治疗Hp感染切实有效的方法。Hp外膜前炎症蛋白(OipA)主要存在于高毒力的Hp菌株,且在潜伏于机体内的球形Hp中也相对高表达,研制oipA疫苗有望获得抗高毒株和球形菌感染的高效疫苗。核酸疫苗是继减毒、灭活和亚单位疫苗之后的第3代疫苗,被誉为预防医学领域的第3次疫苗革命,可以刺激机体同时产生体液免疫及细胞免疫。但核酸疫苗免疫原性较低是抑制其广泛应用的一个主要因素,如何提高核酸疫苗的免疫原性成为研制高效疫苗的关键,此外对于消化道病原的预防,口服疫苗因能引起消化道局部的免疫,从而产生更好的免疫保护性作用。为此本研究拟通过对oipA基因序列进行密码子优化,Kozak前导序列的添加和CpG序列的优化,以期提高oipA核酸疫苗的抗原蛋白表达水平从而提高oipA核酸疫苗的免疫原性,通过构建携带oipA优化基因真核表达载体的SL7207菌株(核酸疫苗的递送系统),并研究其对C57BL/ 6小鼠抗Hp感染的免疫保护作用,以制备抗Hp的口服核酸疫苗。方法:1、oipA优化口服核酸疫苗制备:①利用基因工程技术对oipA基因序列进行密码子优化,Kozak前导序列添加和CpG序列优化,并将优化前后的oipA基因克隆入真核表达载体pVAX1,获得pVAX1-oipA和pVAX1-optioipA重组子。②将重组子与空载体pVAX1瞬时转染AGS细胞,应用Western blot检测转染细胞中OipA蛋白的表达,同时分析优化前后oipA基因的蛋白表达量。③将重组子与空载体pVAX1转化LB5000进行甲基化修饰,提取经过修饰后的质粒电转化终宿主菌减毒沙门菌SL7207,并验证重组减毒沙门菌菌株的稳定性。2、免疫保护实验:60只SPF级C57BL/6小鼠随机分成5组,通过口服介导方法分别接种菌苗(5×108 CFU/只)或PBS,①PBS组(10只);②SL7207组(10只);③SL7207/pVAX1组(10只);④SL7207/pVAX1-oipA疫苗组(15只);⑤SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组(15只),0,2周各免疫一次。末次免疫后2周各采集小鼠眼内100μl,检测抗oipA特异性抗体IgG及亚型IgG1和IgG2a水平。末次免疫后4周用Hp SS1(5×108 CFU/只)攻击免疫后小鼠,攻击3次,隔天一次,末次攻击4周后处死所有小鼠,无菌操作取胃组织和脾脏,胃组织分别作快速尿素酶试验,Hp定量培养和组织病理学检查;脾脏细胞与Hp超声裂解蛋白共培3天后,收集上清测定IFN-γ和IL-4。评价优化前后oipA核酸疫苗的免疫保护作用,初步探讨核酸疫苗的免疫保护机制。结果:1、oipA优化核酸口服疫苗制备:经PCR鉴定,Pst I和Xho I酶切分析及序列测定插入的优化前后oipA基因序列完全正确,表明成功构建了pVAX1-oipA和pVAX1-optioipA真核表达载体。Western blot显示pVAX1-oipA和pVAX1-optioipA真核表达载体能在AGS细胞表达分子量约34 kD的相应蛋白,具有相应的抗原性,且pVAX1- optioipA抗原蛋白表达水平高于pVAX1-oipA。重组减毒沙门菌SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA抽提质粒,经PCR鉴定,Pst I和Xho I酶切分析均获得一条约1 kb的电泳条带,其大小与oipA基因全长序列相符,证明成功构建携带优化前后oipA核酸的SL7207菌株。并证明在没有抗生素选择压力下重组减毒沙门菌能保持其稳定性。2、免疫保护实验:2.1、口服接种oipA核酸疫苗后,C57BL/6小鼠产生抗OipA蛋白的特异性抗体IgG ,且SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组诱导IgG水平明显高于SL7207/pVAX1-oipA疫苗组(p<0.01),血清IgG1,IgG2a滴度变化基本与IgG类似,SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组小鼠血清IgG1,IgG2a的OD值显著高于SL7207/pVAX1-oipA疫苗组(P< 0.01)。2.2、疫苗接种组SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA脾脏细胞上清分泌IFN-γ和IL-4水平均显著增高(P< 0.01);且SL7207/pVAX1-optioipA组分泌IFN-γ,IL-4显著高于SL7207/pVAX1-oipA组(P<0.01),说明优化oipA基因有助于提高Th1和Th2类细胞因子的分泌水平。2.3、口服免疫接种oipA核酸疫苗后能使C57BL/6小鼠产生抗Hp感染的特异性免疫保护作用,SL7207/pVAX1-oipA疫苗组和SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组的免疫保护率分别为40%和73.33%;培养阳性标本中Hp定植密度显著下降(p<0.01)。与SL7207/pVAX1-oipA疫苗组相比,SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组胃组织发生炎症例数明显减少,程度减轻,培养阳性标本中Hp定植密度显著下降(p<0.01),提示SL7207/pVAX1-optioipA疫苗组免疫C57BL/6小鼠抵抗Hp攻击效果优于SL7207/pVAX1-oipA疫苗组。结论:1、成功构建了pVAX1-oipA和pVAX1-optioipA真核表达载体。Western blot显示pVAX1-oipA和pVAX1-optioipA真核表达载体具有相应的抗原性,且通过对oipA基因的优化可提高oipA核酸疫苗抗原蛋白的表达水平。2、成功构建了优化前后幽门螺杆菌oipA口服核酸疫苗,口服免疫接种均能使C57BL/6小鼠产生抗Hp感染的特异性免疫保护作用。且优化的oipA口服核酸疫苗免疫保护作用强于未优化的。3、C57BL/6小鼠口服免疫接种oipA核酸疫苗产生的是Th1型和Th2型混合型免疫应答,且优化oipA基因有助于增强机体细胞免疫应答和体液免疫应答。