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月季是世界公认的四大切花之一,其以花姿优美、花型丰富、花色齐备、花香多型等深受人们喜爱,赢得了“花中皇后”的美誉,被许多国家、城市选为国花、市花。
本研究首先以优良月季品种“萨蔓莎”为试材,以带腋芽的茎段为外植体,比较了含2%有效氯的次氯酸钠不同浸泡时间对外植体的消毒效果,研究了不同激素浓度配比和活性炭的添加对腋芽萌发、增殖及芽苗生根的影响。实验结果表明,用有效氯为2%的次氯酸钠浸泡外植体的最适消毒时间:在春季是8 min,而在秋季为12 min;腋芽萌发的最适培养基是MS+6+6BA1.0 mg/L+NAA 0.1mg/L;腋芽增殖的最适培养基是MS+6-6-BA1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;芽苗生根的最适培养基为1/2MS+0.7 mg/LNAA+0.3%活性炭。以上述系列培养基为基础,建立了“萨蔓莎”的离体培养再生体系,为运用基因工程技术进一步改良该品种奠定了重要基础。
然后,本研究以“萨蔓莎”叶片为试材,对ISSR反应体系中的各主要影响因子进行了优化,建立了月季ISSR-PCR的最适体系:在25μL的PCR体系中,含10×Bufier(无Mg<2+>)2.5μL、1.5 mM Mg<2+>、0.48mM dNTPs、Taql)NA聚合酶1μ、引物0.6 mM和模板20ng。反应程序为:94℃5min;94℃45s,54℃60s,72℃90s,35个循环;72℃6min;4℃保存备用。再以此ISSR-PCR最适体系为基础,从77个ISSR引物中筛选出12个多态性丰富的引物进行PCR扩增,共获得104个DNA片段,分子量在100~2000 bp之间,其中多态性条带96个,占总条带的92.3%。选用其中8个引物进行ISSR-PCR,即可准确区分所有供试的20个月季品种,成功构建了其ISSR分子标记指纹图谱;同时利用PHYLIP法获得了聚类分析图,聚类分析结果表明,供试的20个月季品种可分为5大类。上述ISSR-PCR的研究结果为月季种质鉴定、遗传多样性分析等提供了重要依据。