单核细胞增生李斯特菌（Listeria mnocytogenes,Lm）和伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii,Li）作为李斯特菌属中唯一致病的两个种深受研究者的关注,其中Li主要感染羊、牛等反刍动物,极少引起人类的感染和发病;而Lm除感染动物外还能感染人类,引起人侵袭性和胃肠炎性李斯特菌病。Lm是兼性胞内寄生的病原体,能侵袭宿主的多种细胞（包括吞噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等）进行增殖,并扩散到毗邻的细胞中。Lm能够突破宿主的三道屏障（胃肠道、胎盘和血脑屏障）,引起的李斯特菌病致死率约为20-30%。虽然目前已经发现70多种毒力因子参与该病原菌的粘附、侵入和胞内增殖,但其与宿主互作与致病的分子机制尚未完全阐明,有待通过高通量的组学技术进行深入研究。本研究在前期对强毒株Lm XYSN全基因组测序的基础上,对Lm XYSN中新发现的伊氏李斯特菌来源的基因smcL及其功能进行研究,并初步探讨了其表达产物与李斯特菌溶血素O（listeriolysionO,LLO）之间的关系;此外,还利用动物模型从LmXYSN的转座子突变文库中筛选出与Lm XYSN的高致病力相关的新毒力因子。Lm XYSN中的毒力相关基因的挖掘及功能解析,有助于揭示该菌株高毒力的分子致病机制,为李斯特菌病的预防和控制提供科学的依据。1、自然重组单核细胞增生李斯特菌中smcL基因的功能研究将Lm XYSN smcL的基因序列与数据库进行比对,发现smcL的基因和与Li来源的基因序列同源性为97%,而迄今为止未见Lm中携带smcL基因的报道,因此这是首次在Lm中发现smcL基因。smcL基因编码的鞘磷脂酶C（SmcL）能特异性地作用于鞘磷脂,且具有一定的溶血活性,为Li的重要毒力因子,由此提示,SmcL蛋白的表达很可能在增强LmXYSN毒力中发挥重要作用。为了深入研究Li来源的smcL基因的功能,成功构建了Lm XYSN △hly、LmXYSN△smcL、Lm XYSN Ahly-AsmcL缺失突变株,以及能表达SmcL蛋白的Lm EGDe::pIMK2-smcL 和Lm NTSN::pIMK2-smcL菌株。与马红球菌（Rhodococcus equi,R.equi）的协同溶血试验表明,只有当Lm中smcL基因得到表达时,才会与R.equi形成铲形的溶血现象。通过测定突变株和重组菌株的溶血效价,发现smcL基因的缺失会导致LmXYSN溶血能力下降2倍,而其在Lm EGDe中的表达,则使重组菌株的溶血能力提高了 4倍,提示smcL基因显著增强了 Lm XYSN的溶血能力,很有可能有利于其在体内的感染和致病。对结肠腺癌上皮细胞系Caco-2 BBE进行的体外感染试验显示,smcL基因能显著提高Lm对该细胞系的粘附、侵袭和增殖能力。接下来以口服感染动物模型对smcL基因的功能进行了体内实验,结果表明,在感染72h以后,smcL和hly基因双缺失的突变株与hly基因单缺失的菌株相比,其在肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏中的定殖能力显著降低（P<0.01,P<0.05,P<0.05）。非常重要的是,smcL基因在NTSN中的重组表达显著增强了其在回肠和肠系膜淋巴结中的定殖能力（P<0.01,P<0.001）。总之,以上结果证明smcL基因作为Lm的独有基因,对其宿主体内的生存和内脏组织中的定殖中发挥重要作用,因此该基因是XYSN毒力增强的关键毒力因子之一。2、基于转座突变文库技术筛选的李斯特菌新毒力基因LMxysn₀620的功能研究以BALB/c小鼠口服感染动物模型,筛选Lm XYSN的转座子突变文库。从突变文库中随机挑取500个突变菌株进行口服感染实验,最后获得13株毒力下降100倍以上的突变株。通过反向PCR和基因测序后的比对分析,发现7株突变株的转座子插入位点基因与细胞生长代谢相关（xysn₁358、xysn₁979、n2165、xysn₂795、xysn₁812、sysn₂865、xysn₂030）,3个基因分别与DNA的转录（xysn₀972）、蛋白质的修饰（xysn₁491、xysn₁284）相关,还有2个基因的功能是未知的（xysn₂490、xysn₀620）。利用小鼠口服感染突变株来测定 LD50,xysn₀620::Tn 的毒力（LDs0=107.85CFU）比Lm XYSN（LD50=105.08CFU）降低了 588倍,表明xysn₀620参与Lm XYSN感染小鼠的过程。构建xysn₀620基因的缺失突变株Lm XYSN △0620,对Lm XYSN △0620在不同培养条件下的生长能力进行测定,结果发现缺失突变株与亲本株在BHI培养基和在含有1%Triton的BHI培养基中的生长速率并无差异。在不同培养时间和温度下,对缺失株和野生株的生物被膜形成能力进行测定,结果表明,LmXYSN△0620在42℃形成生物被膜的能力均显著下降（P<0.05,P<0.01）。药敏试验发现xysn₀620基因缺失使细菌对克林霉素（Clindamycin,DA）的抗性由耐受变为中度敏感。以上结果提示,具有跨膜结构的xysn₀620基因编码产物可能为Lm XYSN的细胞结构成分。此外,体外细胞感染实验发现,xysn₀620基因的缺失会引起Lm XYSN对Caco-2BBE细胞黏附、侵袭、增殖的能力均显著性降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01）。最后对LmXYSN△0620缺失株在体内的感染动态进行测定,发现Lm XYSN △0620在小鼠脾脏中定殖的时间晚于野生菌株,在感染后的48h和72h,在脾脏中的定殖能力（P<0.01,P<0.001）和肝脏中的定殖能力（P<0.05,P<0.001）显著弱于野生菌株,提示其在脾脏和肝脏中的定殖能力显著弱于野生菌株。总之,XYSN₀620作为一跨膜蛋白,在Lm抗胁迫应答及对宿主内的侵袭、定植等致病过程中发挥着极其重要的作用。