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第一部分mBAFF介导的载有长春新碱的脂质体在体靶向治疗B淋巴瘤的实验研究研究背景:B淋巴瘤等恶性血液病严重威胁着人类的生命健康,目前用于治疗这些疾病的主要方法是使用大剂量的化疗药物,这无疑会对机体产生极大的毒副作用。近年研究表明,TNF家族的B细胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF)具有良好的B细胞靶向性,能明显促B淋巴细胞增殖,其过表达与B淋巴瘤等多种恶性血液病的发生发展密切相关。然而目前以野生型BAFF为靶向分子进行相关肿瘤治疗的研究,存在促B淋巴细胞来源的肿瘤细胞增殖的潜在危险。而其突变体mBAFF (mutant of soluble BAFF,以两个甘氨酸替换sBAFF中217-224八个氨基酸而获得)保留了良好的B细胞靶向性,但丧失了活化淋巴细胞的功能,因而其不仅是一种理想的靶向载体,而且本身也可用作BAFF的竞争抑制剂来治疗相关的恶性血液病。脂质体包裹化疗药物治疗肿瘤是肿瘤研究领域的“热点”之一,在降低化疗药物毒副作用、提高疗效方面具有诸多优点,但缺乏靶向性。因此我们将mBAFF偶联到载药脂质体表面制成靶向载药脂质体,并且在前期实验中证实mBAFF靶向载有长春新碱脂质体在体外能特异杀伤淋巴瘤细胞,但其体内抗瘤能力如何尚待进一步明确。研究目的:鉴于mBAFF的B细胞靶向性及其竞争抑制作用,并基于脂质体药物靶向治疗在降低化疗药物毒副作用、提高疗效方面的诸多优点,本项目在证实mBAFF靶向载药脂质体在体外能特异杀伤淋巴瘤细胞的基础上拟进一步观察靶向药物在B淋巴瘤细胞模型鼠中的体内抑瘤作用,旨在为B淋巴瘤等恶性血液病的治疗寻找并提供一种新的方法和制剂。研究方法:用人Raji细胞建立荷瘤裸鼠动物模型,并分为6组;各组分别注射靶向脂质体微粒、未偶联mBAFF的脂质体微粒、未用脂质体包封的化疗药物、生理盐水或mBAFF突变蛋白、以及健康对照组,每隔7天给药1次,共5次;采尾血检测白细胞数及其它生化指标;比较各组裸鼠的体重变化、存活时间以及癌细胞在外周血和各个脏器浸润的情况。研究结果:接种人Raji细胞的荷瘤SCID小鼠均出现消瘦、食欲不振、毛色晦暗等体征,小鼠体重均出现不同程度的减轻。从生存时间可以看出,在接受2×107人Raji细胞后,未接受任何治疗的SCID小鼠在11天左右均死亡。A组因为注射靶向脂质体微粒,生存时间最长。免疫组织化学结果显示A组各个脏器癌细胞侵润的情况要比其他几组轻。结论:mBAFF靶向载药脂质体在体内能特异杀伤B淋巴瘤细胞,该靶向载药脂质体具有潜在的应用前景。第二部分基于人mBAFF和PinX1的双效抗瘤分子靶向治疗B淋巴瘤的实验研究研究背景: PinX1(Pin2/TRF1-interacting proteion X1)是一种抑癌基因,核蛋白。它是端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)的强效抑制剂,在抗肿瘤治疗中兼具高效性和安全性的优点,但由于PinX1必须进入肿瘤细胞的细胞核才能与hTERT作用,为此我们拟引入由九个精氨酸组成的具有膜转位作用的寡肽(9L)。我们前期研究证明mBAFF不仅可用作BAFF的竞争抑制剂来治疗相关的恶性血液病,而且是一种理想的靶向载体。因此,本项目拟综合利用mBAFF、9L和PinX1的特点,构建一种基于三者的新型抗肿瘤分子。研究目的:鉴于mBAFF的B细胞靶向性及其竞争抑制作用,并基于九个精氨酸广谱的膜转位作用以及PinX1安全有效的抗瘤作用,本项目拟制备包含mBAFF、9L和PinX1的具有特异靶向性的融合蛋白PinX1/n/c-9L/G4S-9L-G4S/mBAFF,然后经体内外实验比较所制融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用,旨在为B淋巴瘤等恶性血液病的治疗寻找并提供一种高效、安全、特异的靶向双效抗瘤侯选分子。研究方法:拟经DNA重组技术,将编码mBAFF蛋白、具有膜转位作用的寡肽(9L)以及PinX1/n/c蛋白的cDNA重组并克隆于原核表达载体,制备具有特异靶向性的融合蛋白PinX1/n/c-9L/G4S-9L-G4S/mBAFF。免疫组化法和激光共聚焦法检测重组目的蛋白与淋巴瘤细胞(Raji细胞、Namalwa细胞、Daudi细胞)的特异性结合能力及其转位能力;MTT比色实验以及3H-TdR掺入实验观察所制融合蛋白对恶性B淋巴细胞的杀伤作用;流式细胞仪检测重组蛋白诱导恶性血液病细胞(Raji细胞、Namalwa细胞、Daudi细胞)凋亡;端粒酶活性以及端粒长度分析初步探讨融合蛋白体外抑制肿瘤细胞的机制;动物实验观察融合蛋白对荷瘤模型鼠的抑瘤效果。研究结果:1.经RT-PCR成功地克隆了编码人PinX1的cDNA,经查对,与GenBank上登录的相应序列完全一致。以获得的PET28a-PinX1为模板,成功构建了PinX1的n/c端,并分别与具有膜转位作用的寡肽(9L)或G4S-9L-G4S或直接与人可溶性BAFF突变体(mBAFF)的DNA序列重组;2.上述质粒分别转化大肠杆菌BL21DE3,经IPTG诱导后各重组蛋白均获得了较高水平的表达,并确定了各重组蛋白在大肠杆菌中的表达形式;3.各重组蛋白经Ni2+-NTA层析柱纯化后在SDS-PAGE上呈现单一条带,灰度扫描分析证实,各重组蛋白的纯度在90%以上。生物学活性分析显示,本实验所制备的重组突变体蛋白PinX1c-G4S-9L-G4S-mBAFF在与肿瘤细胞表面的BAFF受体靶向结合后,抑制肿瘤细胞生长的效果最好;4.端粒酶活性以及端粒长度分析发现PinX1/c-9l/G4S-9L-G4S/mBAFF重组突变体蛋白能明显抑制端粒酶活性以及缩短端粒长度;5.以Raji细胞尾静脉注射SCID小鼠,建立了人Raji细胞荷瘤SCID小鼠动物模型,成功率达100%,PinX1c-G4S-9L-G4S-BAFF重组突变体蛋白可显著延长荷瘤SCID小鼠的生存时间。结论:这种基于mBAFF、9L和PinX1的新型抗肿瘤分子,在体内外有良好的抑瘤效果,具有潜在的应用前景。