目的:蛋白质是生物大分子,其种类丰富、功能各异,某些纯蛋白制剂已经作为治疗疾病的药物被广泛应用,例如胰岛素。一些学者发现,天然蛋白物质具有抗肿瘤、抗炎和免疫等作用。研究表明,黄芪有着丰富的药用部位,其中黄芪糖蛋白对某些疾病具有免疫抑制的作用,但未知黄芪蛋白成分是否对肿瘤细胞的生长有影响。因此本文对黄芪蛋白成分进行提取纯化,对黄芪蛋白进行体外抗肿瘤活性筛选,进一步对其抑制肿瘤及其中机制进行探讨,同时结合转录组学RNA测序技术,希望能够提高黄芪活性成分的充分利用率,对蛋白类成分抗肿瘤研究提供实验基础。方法:黄芪通过水提盐析及脱盐,得到含有不同分子量的黄芪蛋白溶液。从三种不同的肿瘤细胞中筛选,选择受黄芪蛋白调控变化最显著的一种;细胞计数法计算黄芪蛋白对肿瘤细胞的增值抑制率;采用流式细胞术和PI染色法,观察肿瘤细胞的凋亡和坏死;进一步显微镜下Hoechst33342和PI共同染色,分辨活细胞与死细胞个数改变情况;Western Blot法检测凋亡标志蛋白PARP和caspase-3磷酸化水平、坏死标志蛋白RIP1含量变化;转录组学对比空白组与加药组,分析黄芪蛋白处理后基因差异表达与信号通路改变情况;通过实时荧光定量PCR,深度验证代谢途径受调控后,有关基因的m RNA相对含量变化;Western Blot再次证实通路蛋白水平改变。结果:数据显示黄芪蛋白明显抑制Hep G2细胞的增殖,并存在时间与浓度依赖性。流式细胞仪结果表明,坏死细胞的数量会随着黄芪蛋白浓度的增加而变多,其中100μg/m L浓度组的坏死率达到18.78%。通过荧光显微镜观察,对比空白组,黄芪蛋白处理浓度的升高直接导致PI染色的红色坏死细胞变多,而Hoechst33342染色的蓝色正常细胞则显著变少。Western Blot结果显示,黄芪蛋白处理Hep G2细胞后对凋亡蛋白无影响,而明显上调坏死标志蛋白RIP1磷酸化水平。这表明,黄芪蛋白可能是通过诱导肝癌细胞坏死,发挥抑制增殖的作用。接下来为探究增殖抑制作用的具体机制,将处理后的细胞RNA进行测序并对结果进行分析。首先经过基因火山图和聚类分析图可以发现黄芪蛋白处理后,有很多基因发生显著性的差异表达,因此进一步探究加药处理后具体通路改变。KEGG分析显示,经过黄芪蛋白处理后p53代谢途径明显与空白对照组不同,该途径排名全部通路前三位。根据文献调查发现,p53信号通路与细胞发生程序性坏死有关,并且p53的变化直接致使部分基因的改变。实时荧光定量PCR进一步证实,与转录组学数据相比,p53途径有关基因的表达水平一致。结果说明测序结果是可靠的。Western Blot结果发现黄芪蛋白处理细胞后能够显著上调p53蛋白的表达,由此证明,黄芪蛋白通过影响p53信号通路导致Hep G2细胞发生程序性坏死,从而导致肝癌细胞的生长受到抑制。结论:本研究显示黄芪蛋白提取物具有明显的抗肿瘤效果,并发现和证明了黄芪蛋白的抗肝癌细胞的分子机制,不仅为黄芪蛋白抗肝癌提供了依据,同时为今后蛋白类化合物抗肿瘤研究提供了参考。