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基因表达调节由一个复杂的网络组成。基因调节主要在转录水平完成。不同的基因在不同类型的细胞被转录，并对不同的刺激产生反应，如激素、生长因子、应激、损伤、和炎症，调控细胞周期、细胞增殖、分化及细胞迁移、细胞之间的相互作用。研究显示转录因子在基因转录过程中起关键作用。近十年来的基因工程技术的巨大进步，使阐明转录因子的结构、信号转导途径、调控机制成为可能。1986年由Ranjan Sen 等人在B细胞中发现一种结合于免疫球蛋白κ轻链增强子上的核蛋白，命名为NFκB。进一步研究发现NFκB是一种重要的核转录因子，已有五个家族成员被克隆，存在于多种细胞，参与炎症、免疫、细胞增殖、细胞凋亡等多种生理、病理过程。近10年来，随着对NFκB研究的不断深入，人们发现大约有150种基因受NFκB调控。可以调控早期反应基因的表达，包括细胞与细胞之间的相互作用，细胞间的信息传递，细胞募集或迁移 ，早期发病信号的扩大或播散，起始及加速肿瘤的发生等等。与此同时，由于其在炎症、肿瘤发病中的重要意义，以NFκB作为治疗的靶点，研发新的治疗策略和治疗方法的工作受到越来越多的关注。目的：研究核转录因子NFκB对急性早幼粒细胞白血病组织因子的调控，通过核转录因子NFκB及其抑制因子IκB的表达探讨三七总甙对NB4细胞组织因子的调节机制，及三七总甙对NB4细胞组织因子mRNA水平、细胞膜表面抗原水平以及对NB4细胞诱导分化的影响，由此探索DIC新的治疗策略与方法。方法：1 细胞采集和培养：采集30例APL患者新鲜骨髓液及10例正常人外周血5ml，肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离单个核细胞。急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞培养于含10%灭活胎牛血清（Gibco BRL），青霉素100U/ml及链霉素100U/ml的RPMI1640培<WP=5>养液中，于5%CO2，饱和湿度为100%，37℃培养箱中悬浮培养，每2-3天传代1次。实验用对数生长期细胞，胎盘蓝染色拒染率均在95％以上。三七总甙，储存液浓度100mg/ml，实验前用不含血清的RPMI1640培养液稀释至工作液浓度。2 RT-PCR检测TFmRNA及IκBαmRNA表达水平 TRLzol RNA提取试剂盒提取APL细胞及NB4细胞总RNA, 以M-MLV逆转录合成cDNA, 引物设计与扩增参照文献。TF上游引物(575-594bp):5’- GAA GGA ACA ACA CTT TCC TA-3’，下游引物(788-765bp):5’-GG GCT GTC TGT ACT CTT CCG GTT A-3’， PCR扩增条件为94℃, 30s; 60℃, 30s; 72℃, 45s; 35个循环，72℃延伸10分钟，扩增片段长度213bp。IkBα扩增片段长度562bp，上游引物序列：5’-tattctccctaccagctcac-3’；下游引物：5’-cactcctggctgttacatgtcac-3’。扩增条件：94℃，40s, 58℃,40s , 72℃,60s, 30个循环。1.8％琼脂糖凝胶电泳（含EB5μg/ml），90V，40分钟，在紫外线灯下观察结果，读胶仪（Alpha ImageTM 1220 & documentation Analysis System,Alpha Innotec Corporation,USA）扫描定量。3三七总甙对NB4细胞增殖抑制作用 将对数期生长的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔200μl（细胞浓度2×105/ml），培养结束前6小时加入20μl MTT（5mg/ml）,离心培养板10分钟，弃上清，加入200μl DMSO，振荡溶解甲替结晶，酶标仪( BIO-RAD ) 490nm 测吸光度A值，绘制细胞生长曲线。4 三七总甙对NB4细胞诱导分化影响 收集NB4细胞，离心，加终浓度为1.0mg/ml NBT和20ng/mlTPA，37℃孵育20min，离心涂片，瑞-姬氏染色，光镜下计数200个细胞，细胞内有蓝黑色斑为阳性，计数NBT阳性细胞百分率。细胞形态学: 细胞瑞-姬氏染色，光镜下观察细胞形态并照相。流式CD11b,CD14测定：收集200μg/ml处理第4天，第6天的NB4细胞，冷PBS洗两遍，加入CD11b，CD14抗体，孵育30min，流式细胞仪(FACSCalibur)检测。流式细胞术观察NB4细胞周期：取200μg/mlPNS处理72hNB4细胞及对照组NB4细胞1×106个，4℃、1000r/min离心5min，弃上清；细胞沉淀以1mlPBS洗2遍，75％乙醇固定，－20℃过夜；4℃、400×g离心5min，弃上<WP=6>清，细胞沉淀以1mlPBS洗2遍，加入碘化丙啶（20μg/ml）染色30min，流式细胞仪检测，CellQuest软件获取数据，ModFit LT 2.0软件进行细胞周期分析，计算G0-G1 期、S期及G 2-M期细胞百分比。5 三七总甙对NB4细胞促凝活性(PCA)影响：收集细胞，调整细胞浓度为1×107/ml, 取50μl细胞悬液加等体积健康人混合血浆（NHP, 含凝血因子, 包括FVII）于37℃孵育3min，再加入0.025M氯化钙50μl，记录凝固时间, 凝固时间越短，则PCA越高。6流式细胞术检测三七总甙对NB4细胞表面组织因子抗原影响： 三七总甙各处理组NB4细胞2mmol/LEDTA-PBS洗涤，10mmol/L-EDTA-PBS孵育20分钟，2mmol/LEDTA-PBS洗2次，FITC标记TF单抗4℃避光30min,PBS洗涤两遍，流式细胞仪(FACSCalibur)检测。7 Western blot检测NFκB及其抑制因子IκBα蛋白表达 提取三七总甙各处理组NB4细胞，分离单个核细胞，加入低渗缓冲液（临用前加DTT0.5mmol,，PMSF0.2mmol10μl，10％NP－40 10μl），振荡悬浮细胞，4℃冰浴15分钟，400g离心5min，（细胞核沉淀留用），取上清12000g再离心5分钟，上清液为细胞浆蛋白，置﹣30℃保存。考马斯蛋白定量法定量，检测细?