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本论文以荔枝霜疫霉病菌作为供试菌,利用含毒介质菌丝生长速率法,在离体条件下对采自广东河源、广西灵山、湖北石堰及江西吉安等地35科35属39种植物的甲醇提取物进行抑菌活性的筛选,结果确认甘草甲醇提取物对荔枝霜疫霉菌菌丝生长有较突出的抑制活性,随后采用活性跟踪法较系统的研究了甘草提取物的抑菌活性、活性成分的分离纯化及其鉴定,并对活性成分的作用机理作了初步研究。
39种供试植物的甲醇提取物对荔枝霜疫霉病菌的抑菌活性筛选结果表明,10mg/mL干粉浓度时,野核桃、百部、盾叶薯蓣(根)、苦参、水菖蒲、朱砂藤、八角莲、筒鞘蛇菰、白花油茶、甘草等10种植物提取物对荔枝霜疫霉菌菌丝生长的抑制率达75%以上,其中盾叶薯蓣(根)、水菖蒲、甘草具有很强的抑菌作用,抑菌率分别达98.45%、94.09%和97.83%,明显高于其他它植物。
甘草的最佳提取溶剂为甲醇,且实验结果表明,栽培甘草与野生甘草在同浓度下对荔枝霜疫霉菌的抑菌活性并无明显差异。
生测结果表明,甘草甲醇提取物对荔枝霜疫霉病菌、辣椒疫霉病菌、芒果炭疽病菌菌、香蕉枯萎病菌、草莓叶斑病菌有不同的抑菌活性,在浓度为5mg/mL时抑菌率依次为100%、84.88%、27.52%、49.43%、66.73%,显示出对荔枝霜疫霉病菌、辣椒疫霉病菌有很强的抑制作用。同时,甘草甲醇提取物对荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌发芽管也显示了较好的抑制活性。
通过液-液分配萃取法及活性跟踪,发现甘草甲醇提取物的抑菌活性成分主要在乙酸乙酯萃取物中;通过对乙酸乙酯萃取物进行柱层析分离、纯化及活性跟踪,得到活性物质为一黄色块状结晶物,用化学试剂对所得化合物进行化合物类别的初步检测,结果表明,该活性化合物可能为黄酮类物质。
运用紫外光扫描、质谱、核磁共振及红外光谱等分析技术,对活性化合物进行了分子结构解析,经查阅文献资料及分析对比,鉴定该化合物为异甘草甙(Isoliquiritin),属甘草中已知的黄酮甙类化合物。
研究表明,异甘草甙对荔枝霜疫霉病菌菌丝生长及孢子囊萌发均有抑制作用,在处理浓度为100μg/mL时对其孢子囊萌发抑制率达82.50%,而供试浓度为400μg/mL时对其菌丝体生长的抑制率达100%。离体抑菌试验还表明,异甘草甙对辣椒疫霉病菌也具有较好的抑制活性,在供试浓度为400μg/mL时对其菌丝体生长的抑制率达97.34%。研究表明,异甘草甙能较好的预防荔枝霜疫霉病菌及辣椒疫霉病菌的侵染,在处理浓度为400μg/mL时,10天后其防效分别达到76.01%和86.46%。异甘草甙对荔枝霜疫霉病菌的抑菌作用机理的研究表明,经80μg/mL浓度处理4d后,在电子显微镜下可以观察到菌丝体形态有明显变化,菌丝体增粗,菌丝体肿胀、扭曲、皱缩,有的菌丝体出现断裂,孢子囊梗及菌丝体呈现塌陷,孢子囊紧缩干瘪;经异甘草甙30、50、70μg/mL浓度处理8h后的孢子囊虽有萌发,但芽管粗短,萌发位点多,芽管基部多分支,芽管伸长时有结节状膨胀或扭曲,显示出受到了药剂的抑制作用。
供试浓度40、80、120μg/mL活性成分处理荔枝霜疫霉病菌后,其培养液电导率随浓度及处理时间增加而升高,表明活性成分可能改变了菌体细胞膜的通透性。研究还表明,经处理浓度为40、80、120μg/mL的活性成分处理荔枝霜疫霉病菌后,菌丝体内可溶性蛋白含量先升后降,24h后降至对照水平;而其菌丝体内还原糖的含量则一直低于对照水平,表明活性成分抑制了荔枝霜疫霉病菌的葡萄糖吸收。