论文部分内容阅读
哺乳动物防御素由于抗菌能力强、抗菌谱广、不易使病原微生物产生耐药性等优点而受到人们广泛关注。因此防御素被认为是一种替代传统抗生素的新型抗微生物制剂,具有广阔的应用前景。猪β防御素2在体外表现出很强的耐盐和热稳定性,较低浓度的p BD2即可对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的杀灭作用。p BD2对炎症反应也有一定作用,但是其调控机制还不清楚。TLRs介导的NF-κB和MAPK信号通路在炎症反应中起关键作用。为了探究p BD2是否通过TLRs介导的信号通路对肠道上皮细胞的炎症反应起作用,本实验利用大肠杆菌感染IPEC-J2细胞,荧光定量检测TLR1-9的表达变化,探索了大肠杆菌感染IPEC-J2细胞最适的浓度和时间。在细胞培养液中添加不同浓度(0μg/m L、20μg/m L、40μg/m L、80μg/m L)的p BD2,分别在培养2h、4h、6h、8h后收集细胞。用荧光定量和蛋白免疫印迹的方法,检测细胞肠道TLRs(Toll-like receptors)和通路蛋白基因的表达量,以期得到防御素对肠道上皮细胞的作用机制。实验结果如下:(1)在大肠杆菌感染IPEC-J2细胞中,最适的感染浓度和时间分别是107和1h。显微镜观察显示:在感染2h后,有少量细胞死亡;在感染4h和8h后,死亡增加;在感染8h后出现成团的死细胞,细胞形态发生变化。肠道紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2基因的表达量显著降低,表明大肠杆菌侵染导致细胞屏障受损。(2)在大肠杆感染细胞后,TLRs中只有TLR4、TLR5和TLR7显著升高,IκB-α/NF-κB和TAK1/JNK信号通路中相关基因表达显著升高,炎性因子IL8的表达也显著升高,说明在大肠杆菌感染细胞中TLRs、IκB-α/NF-κB和TAK1/JNK信号通路可能与炎症反应有关。(3)在大肠杆菌感染IPEC-J2细胞中添加p BD2发现IκB-α/NF-κB变化不明显,TAK1/JNK显著下降,p38 MAPK无显著变化,同时IL8表达下调。说明p BD2有一定的消炎作用,而TAK1/JNK可能在消炎过程中发挥作用。(4)大肠杆菌侵染细胞2h后,p BD2表达量显著下降,加入外源性p BD2后,表达量显著升高。