整齐排列在牙髓牙本质复合体最外层的成牙本质细胞是牙髓内首先接触外来病原微生物刺激的细胞，近年来的研究发现成牙本质细胞除了具有形成牙本质有机基质的能力外，还能释放细胞因子、趋化因子和抗菌肽等，从而参与了牙髓牙本质复合体的天然及获得性免疫防御反应，利于清除入侵病原体。然而，成牙本质细胞确切的防御机制、它们如何识别和捕获外来抗原这些问题尚不清楚。Toll样受体是新近发现的最重要的病原相关分子模式识别受体，能识别包括细菌、支原体、病毒等各种外源性配体或坏死细胞、纤维连接素等内源性配体并迅速告知宿主发挥重要的预警作用。TLRs在机体天然免疫和获得性免疫之间架起一座桥梁，协调天然免疫和获得性免疫以共同抵抗病原微生物或病变坏死组织等。现今已发现10个人类Toll样受体家族成员，它们分别对不同的病原体相关分子模式进行识别。TLR4是研究最早，功能最为明确的TLRs家族成员，它能够与脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和热休克蛋白等内、外源性配体结合。牙髓、根尖周病是以G-感染为主的混合感染，LPS是革兰阴性菌最主要的毒力因子。那么成牙本质细胞和牙髓组织是否通过表达TLR4等TLRs进行免疫防御的？TLR4信号通路是否影响牙髓损伤修复？我们用四个部分对此进行了研究。 第一章Toll样受体4在人正常牙髓组织和成牙本质细胞中的表达目的：研究人正常牙髓组织和成牙本质细胞中TLR4表达与分布特点，探讨TLR4在牙髓组织天然免疫防御中的可能作用。 方法：从新鲜拔除的人健康第三磨牙获取牙髓组织和成牙本质细胞，扫描电镜观察牙髓摘除后髓腔壁成牙本质细胞形态和附着情况；RT-PCR检测人牙髓组织以及成牙本质细胞中TLR4mRNA的表达情况；采用免疫组织化学技术和免疫印迹方法检测TLR4蛋白的表达与定位。 结果：扫描电镜观察牙髓摘除后成牙本质细胞大部存留在髓室壁上，细胞形态良好；RT-PCR结果发现正常牙髓组织、成牙本质细胞均可表达TLR4mRNA，产物大小为278bp；免疫印迹法检测正常牙髓、成牙本质细胞在89kDa附近出现蛋白条带；免疫组化显示正常牙髓组织中的成牙本质细胞、血管内皮细胞TLR4免疫反应阳性。正常牙髓中牙髓成纤维细胞不表达TLR4。结论成牙本质细胞通过表达TLR4参与牙髓牙本质复合体的先天免疫反应，TLR4在牙髓抵御外来病原微生物入侵的宿主免疫防御中起重要作用。 第二章Toll样受体4在人炎症牙髓组织和大鼠牙髓损伤修复模型中的表达目的：研究TLR4在人炎症牙髓组织以及大鼠牙髓损伤修复模型中的分布及表达情况，了解TLR4与牙髓炎症发生以及炎症损伤修复的关系。 方法：收集人炎症牙髓组织标本，采用免疫组织化学技术对TLR4的表达进行定位，同时利用免疫印迹杂交的方法对蛋白表达水平进行半定量分析。利用髓腔单纯开放法建立大鼠牙髓损伤修复模型，通过组织病理学检查观察牙髓炎症发生与转归的整个过程，利用免疫组化技术定位TLR4阳性细胞。 结果：westernblotting结果显示人炎症牙髓组织TLR4的相对表达量是正常牙髓组织的两倍左右，经studentt检验，两者有显著性差异(p＜0.05)，免疫组化结果发现正常情况下不表达TLR4的牙髓成纤维细胞也有TLR4的表达。利用髓腔单纯开放法成功建立了大鼠牙髓损伤与修复模型，观察到28d左右有修复性牙本质桥形成。免疫组化检测观察到TLR4阳性的成牙本质细胞样细胞向成牙本质细胞受损处迁移并形成第三期牙本质。 结论：炎症牙髓TLR4表达上调，TLR4参与了牙髓组织炎症发生以及损伤修复的过程。 第三章Toll样受体4在牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的表达目的：建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系，研究TLR4在体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的表达情况，对体内研究结果进行验证。 方法：利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定，使用矿化诱导液诱导牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化。观察细胞形态改变和碱性磷酸酶活性变化，用Vonkossa染色法观察诱导后的细胞形成矿化结节的能力，对细胞增殖情况使用流式细胞仪进行细胞周期测定。以免疫荧光FITC法观察TLR4在诱导分化后的细胞中的表达，采用RT-PCR检测与成牙本质细胞分化相关基因以及TLR4基因在诱导分化过程中的表达情况，同时用westernblotting方法检测诱导过程中TLR4蛋白表达情况。 结果：获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性，角蛋白阴性，证明为中胚层来源的细胞。诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期；3周左右开始有细胞结节形成，周围细胞呈放射状排列，部分细胞出现细长突起并呈极性排列。4周左右细胞团中央VonKossa染色为阳性。免疫荧光法FITC检测诱导3周后的细胞可见TLR4表达阳性。细胞周期的检测结果表明诱导分化后细胞增殖变慢，多数细胞处于G0G1期。与未诱导的细胞相比，矿化诱导开始3周碱性磷酸酶活性逐渐升高，但到第四周后活性有所降低，经统计学分析有显著性差异。矿化液诱导组细胞RT-PCR产物凝胶电泳可见诱导细胞和未经诱导的对照细胞在整个诱导分化过程均可表达OCN、Ⅰ型胶原(COL-1)。未诱导细胞未见TLR4、DSPP、NESTIN扩增产物条带，诱导3周和4周后TLR4、DSPP、NESTIN明显表达。TLR4蛋白表达与基因表达情况基本一致，在矿化诱导3周后开始表达，4周时表达增强。 结论：建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系，所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能，是研究成牙本质细胞的较好模型。TLR4蛋白和mRNA在体外诱导分化的成牙本质细胞样细胞均有表达。 第四章LPS对成牙本质细胞TLR4表达和形成牙本质基质的影响目的：了解LPS对成牙本质细胞样细胞TLR4表达的调控，探讨TLR4介导下LPS对成牙本质细胞样细胞形成牙本质有机基质能力的影响。 方法：以LPS作用于培养的成牙本质细胞样细胞，用荧光定量RT-PCR和westernblotting的方法检测TLR4的基因和蛋白表达变化情况。同时用TLR4阻断肽预处理后再对LPS活化的成牙本质细胞样细胞DSPP、OCNmRNA的表达进行实时荧光定量RT-PCR分析，用碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性改变情况。 结果：LPS作用后成牙本质细胞样细胞TLR4基因和蛋白表达改变情况经统计学检测无显著性差异。LPS作用对成牙本质细胞碱性磷酸酶活性的影响没有统计学差异，但是Q-RT-PCR结果显示LPS能显著抑制DSPP和OCN的表达。TLR4抗体阻断肽不能完全阻断LPS对成牙本质细胞样细胞的影响。 结论：LPS能显著降低成牙本质细胞合成有机基质，阻断TLR4通路并不能完全抑制LPS对细胞的影响。