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微生物发酵是绿色生物制造的重要技术手段,其核心在于高效细胞工厂的构建。大肠杆菌具有遗传背景清晰、技术操作简单、生长繁殖快速、大规模发酵方便等优点,已成为细胞工厂的优秀底盘宿主。利用代谢工程理性设计细胞代谢途径可有效提高糖等底物的转化效率,而糖的跨膜转运是其进入代谢的第一步。大肠杆菌对糖的运输具有专一性,它依赖于细胞质膜上的特异性转运蛋白,并以主动运输或协助扩散的方式完成。这一特点不仅会导致底物范围狭窄,还会引发“饱和现象”、抑制物敏感、碳分解代谢物阻遏（CCR）等问题。最理想的解决方案是在不过度干扰细胞生命活动的前提下,开发高效的糖扩散通道,促使糖分子利用细胞膜两侧的浓度差,通过简单扩散方式进入细胞质。大肠杆菌的SecY蛋白转位通道定位于细胞质膜,其突变复合体SecY（ΔP）EG（删除栓塞结构域）与细胞外膜致孔蛋白（SCVE）共同表达可实现单糖分子简单扩散跨膜。尽管如此,SecY（ΔP）通道的单糖转运效率及优势尚不明确,且其在细胞工厂中的应用未曾被开发。此外,目前SecY（ΔP）通道运输乳糖等二糖的能力仍较差。基于上述问题,本论文首先对SecY（ΔP）通道转运单糖的优势进行评价。其次,将通道应用于木糖醇合成途径,实现碳代谢流自动控制。同时,借助SecY（ΔP）通道建立了D-阿洛酮糖的发酵制备法。最后,定点突变通道的氨基酸孔环,有效改善了乳糖转运效果。具体内容和结果如下:1.SecY（ΔP）通道转运单糖的优势评价。利用C14同位素示踪技术证实SecY（ΔP）通道可高效转运单糖。使用SecY（ΔP）通道替代葡萄糖PTS的重组菌株在100 g/L葡萄糖上的比生长速率为0.228 h-1,比野生型高80%,打破了转运“饱和现象”。当存在葡萄糖竞争性抑制剂时,重组菌株生长不受影响。在混糖（木糖和葡萄糖）发酵实验中,重组菌株实现了糖的同步利用,且比生长速率从0.174 h-1提高到0.309 h-1。由上可知,SecY（ΔP）通道转运单糖比特异性转运蛋白更具优势,为其后续的应用研究提供了理论基础。2.借助SecY（ΔP）通道实现木糖醇高效合成过程的碳代谢流自动控制。木糖发酵实验表明,利用SecY（ΔP）通道能彻底解除木糖醇-磷酸对细胞转运木糖的抑制问题。引入木糖醇合成途径后,在SecY（ΔP）通道与CCR效应的协同作用下进行混糖（木糖和葡萄糖）发酵实验。当葡萄糖存在时,木糖瞬时消耗率≈0.81 m M·h-1·OD-1,木糖醇瞬时得率≈0.72mol/mol。当葡萄糖耗尽后,木糖瞬时消耗率≈1.51 m M·h-1·OD-1,木糖醇瞬时得率≈0.25 mol/mol,表明细胞可自动调节木糖代谢通量。新型细胞工厂在木糖醇合成过程中,不仅实现了葡萄糖和木糖的同步转运,而且能够根据葡萄糖的浓度变化自动调整木糖的代谢流分配,有效提高了产物木糖醇的得率。3.借助SecY（ΔP）通道实现D-阿洛酮糖合成的底物非磷酸化转运。利用SecY（ΔP）通道和D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPEase）成功构建以果糖为底物合成D-阿洛酮糖的细胞工厂,得率≈0.05 g/g。依次敲除底物磷酸化途径和副产物合成途径,D-阿洛酮糖得率提高到≈0.59 g/g。进一步调控糖酵解途径的碳代谢通量,D-阿洛酮糖得率最终可达到≈0.95g/g。筛选发酵培养基后,使用补料分批发酵的方式制备D-阿洛酮糖,最终产量≈23.3 g/L,对数生长期的时空产率≈1.03 g/（L·h）。4.SecY（ΔP）通道的氨基酸孔环突变及其乳糖转运功能探索。绿色荧光蛋白（GFP）表达实验证明SecY（ΔP）通道可微量转运乳糖。为提高通道的乳糖扩散效率,利用定点非随机突变将其氨基酸孔环的6个异亮氨酸（Ile）全部突变为缬氨酸（Val）,突变菌株E.coli（ΔLac Y,SecY[ΔP,Val],SCVE）利用乳糖为唯一碳源的生长周期明显缩短。在此基础上,通过定点随机突变筛选,得到了突变菌株E.coli 2RM53,其在对数生长期的比生长速率进一步提高了13.1%。结果说明对SecY（ΔP）孔环氨基酸的适当调整,可有效提高其乳糖转运能力,为利用大肠杆菌的SecY（ΔP）通道转运其它二糖分子奠定了基础。综上所述,基于SecY（ΔP）通道建立的简单扩散跨膜系统能够有效克服大肠杆菌特异性糖转运系统的缺陷,并被成功应用于合成木糖醇和D-阿洛酮糖的细胞工厂。氨基酸孔环突变后的SecY（ΔP）通道扩散乳糖的效率显著提高,后续有望作为大肠杆菌的非特异性二糖转运通道。