第一部分、HE4对子宫内膜癌和胰腺癌细胞周期的调控　　背景和目的：子宫内膜癌是最常见的妇科肿瘤之一，胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一。对这些肿瘤更加有效的治疗依赖于对其病理机制的更深入了解。最近研究发现分泌性糖蛋白人附睾蛋白4（Human epididymis protein4，HE4，或者WFDC2）在子宫内膜癌和胰腺癌中过表达；HE4过表达子宫内膜癌细胞系的鼠皮下移植瘤表现出更快的肿瘤生长速度。然而，HE4在肿瘤细胞周期中的功能尚未有详细的研究。由于HE4可以被分泌到细胞外，细胞外 HE4在肿瘤生长中的功能问题尚待解决。在本研究中，我们旨在探讨内源性和外源性的HE4蛋白对子宫内膜癌和胰腺癌细胞系的细胞周期作用及其调控机制，为抗癌治疗的药物开发奠定基础。　　方法：在HE4稳定下调和过表达的子宫内膜癌克隆细胞系，我们利用实时定量PCR（QPCR）和蛋白质印迹（Western blot）技术分别研究细胞周期相关因子c-Myc、CDK4、CDK1、Cyclin E1、Cyclin A2、p15和p21的mRNA和蛋白表达水平。细胞增殖通过细胞计数测定。采用5-溴-2’-脱氧尿苷（Bromodeoxyuridine，BrdU）掺入试验和组蛋白H3 Ser10残基的磷酸化(pH3Ser10)染色分别检测S期DNA合成和M期细胞分裂指数。用瞬时HE4过表达，检测HE4在G1/S和G2/M关卡中的时序效应。用重组HE4蛋白处理子宫内膜癌和胰腺癌细胞，并通过MTS细胞增殖试验和细胞计数观察细胞增殖的变化；用BrdU掺入试验检测S期DNA合成；通过QPCR和Western blot技术分别研究细胞周期相关因子PCNA和p21的mRNA和蛋白表达水平的变化。　　结果：　　1.与对照组相比，HE4在Ishikawa细胞中稳定下调后，细胞增值率、S期DNA合成和细胞分裂指数都出现显著下降（p<0.05）；细胞周期促进因子包括c-Myc、CDK4、CDK1、Cyclin E1和Cyclin A2的表达显著下降，而细胞周期抑制因子如p15和p21显著上升（p<0.05）。　　2.HE4在 HEC-1B细胞中稳定过表达后，细胞增值率、S期DNA合成和细胞分裂指数都高于对照组（p<0.05）；c-Myc、CDK4、CDK1、Cyclin E1和Cyclin A2的表达显著增加，而细胞周期抑制因子如p15和p21的表达显著下降（p<0.05）。　　3.与对照组相比，HE4在HEC-1B细胞中瞬时表达以后，细胞增殖率、S期DNA合成和细胞分裂指数都显著增加（p<0.05）；当HE4在HE-1B细胞中瞬时过表达时，Cyclin E1的变化比CDK1早。　　4.与不含HE4蛋白的对照组相比，重组HE4蛋白显著地促进子宫内膜癌和胰腺癌细胞增殖和S期DNA合成（p<0.05）；同时，重组HE4也促进PCNA表达，而抑制p21表达（p<0.05）。　　结论：HE4通过调节细胞周期相关基因的表达促进子宫内膜癌和胰腺癌细胞增殖。HE4可能经过G1/S关卡参与细胞周期调控。细胞外的外源性 HE4也可发挥与细胞内HE4相似的功能，加速子宫内膜癌和胰腺癌的增殖，但外源性HE4如何将细胞增殖信号传递到细胞内有待进一步研究。HE4可能是子宫内膜癌和胰腺癌的一个潜在治疗靶点。　　第二部分、胰腺癌中Syncytin-1启动子高甲基化和表达下调　　背景和目的：Syncytin-1是人内源性逆转录病毒 W基因家族的一个成员。Syncytin-1在人胎盘滋养层表达，介导细胞滋养层细胞融合形成合胞滋养层，即滋养层细胞的终末分化形式。另外，体外研究表明syncytin-1还具有非细胞融合功能，例如免疫抑制、细胞周期调控和抗凋亡活性。很多肿瘤组织，包括乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌，存在syncytin-1过表达。Syncytin-1基因5’LTR的DNA低甲基化与syncytin-1基因的过表达密切相关。胰腺癌中位生存时间少于6个月，大部分病人是在晚期才得到诊断，目前治疗措施的效果极其有限。有研究表明，在胰腺癌发生的早期，部分基因的甲基化状态变化明显，可作为胰腺癌早期诊断的依据之一。Syncytin-1在人类正常胰腺和胰腺癌组织中的表达模式和潜在的生物学功能尚待解决。本研究中，我们旨在探讨syncytin-1在人类正常胰腺和胰腺癌组织中的表达和甲基化情况，为胰腺癌的表观遗传药物治疗提供前期研究基础。　　方法：应用实时定量PCR、Western blot和免疫组化方法，分别检测正常胰腺和胰腺癌组织中syncytin-1基因的mRNA和蛋白表达水平。结合组织芯片中syncytin-1的表达水平和临床参数进行分析，评价syncytin-1表达与胰腺癌之间的相关性。采用COBRA和重亚硫酸盐测序法分析syncytin-1基因启动子区5’LTR的甲基化状态，并评价胰腺癌组织中syncytin-1基因甲基化水平与其表达水平之间的关系。　　结果：　　1.正常胰腺组织和癌旁组织都表达 syncytin-1。与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中syncytin-1表达下降（p<0.05）。　　2.Syncytin-1的表达水平与肿瘤分期、组织学分级和性别无相关性（p>0.05），而与病人的年龄负相关（n=51,r=-0.300,p=0.032）。　　3.与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中syncytin-1基因启动子区5’ LTR呈现出高甲基化状态（p<0.001）。　　4.Syncytin-1基因启动子区5’LTR中第2个和第3个CpG位点的甲基化水平在正常胰腺组织和胰腺癌组织中变化明显（p=0.024,p=0.049），并且第2个CpG位点的甲基化水平与syncytin-1的mRNA表达水平负相关（r=-0.558,p=0.001）。然而总的甲基化水平在两种组织中并无明显差别（p>0.05）。　　结论：人类胰腺组织存在 syncytin-1表达，并且胰腺癌组织中syncytin-1表达下降。胰腺癌组织中syncytin-1基因启动子区5’LTR高甲基化状态导致其在胰腺癌组织中低表达，尤其是靠近转录起始位点的第2个和第3个CpG位点的甲基化水平对syncytin-1的表达具有非常重要的调控作用。鉴别出围绕转录起始位点的2个 CpG二核苷酸作为关键的表观遗传元件，为进一步研究syncytin-1在胰腺癌细胞中的表观遗传调控提供了有价值的信息。Syncytin-1可能是胰腺癌的表观遗传药物治疗的潜在靶点。