论文部分内容阅读
大白菜(B.rapa L.ssp.pekiensis)起源于中国,是我国重要的蔬菜作物之一。病毒病是大白菜生产中的三大病害之一,严重影响了大白菜的生产。经鉴定,芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)是侵染大白菜的主要病原。本研究基于大白菜抗TuMV的隐性基因retr02(编码eIF(iso)4E蛋白),开发功能标记,用于分子标记辅助选择育种,并通过酵母双杂交试验对TuMV株系与大白菜eIF(iso)4E基因间互作关系及互作关键位点进行分析研究,获得以下研究结果:1、经过retr02和Retr02序列比对发现,retr02由于exon1/intron1连接处的Insert G造成错误剪切,以致翻译时提前终止,致使功能丧失。在该位点处开发KASP_retr02和dCAPS-BslI标记,对142株F2单株进行筛选鉴定,鉴定结果与接种病毒后ELISA检测结果一致。将KASP_retr02和dCAPS-BslI标记用于分子标记辅助育种,对118份自交系材料进行筛选,选出抗病材料2份,感病材料116份。‘80186’为国家级抗病亲本材料,但KASP_retr02和dCAPS-BslI标记的检测结果却为感病。推测‘80186’材料不含有retr02抗病位点,应该含有其他抗病基因或抗病机制。dCAPS-BslI标记和KASP_retr02标记的检测结果一致,但dCAPS-BslI标记操作复杂,而KASP_retr02便于生产上使用。2、白菜作物中eIF(iso)4E基因含有三个拷贝,分别为eIF(iso)4E.a、eIF(iso)4E.b和eIF(iso)4E.c,经鉴定,eIF(iso)4E.b为假基因。通过酵母双杂交试验表明:pGBKT7:C4 VPg与pGADT7:eIF(iso)4E.a可以相互作用,而与pGADT7:eIF(iso)4E.c不能相互作用;pGBKT7:CDN1VPg与eIF(iso)4E.c相互作用,而与pGADT7:eIF(iso)4E.a不能相互作用。不同的TuMV株系与不同的eIF(iso)4E拷贝进行互作。3、通过对eIF(iso)4E蛋白三级结构分析,该蛋白包含有帽结合蛋白结构,其中eIF(iso)4E.a与eIF(iso)4E.c之间存在20个差异氨基酸,其中17个差异氨基酸位于帽结合蛋白结构上(占85%)。病毒侵染植株,在翻译起始因子异构体eIF(iso)4E与TuMV-VPg相互作用的过程中,eIF(iso)4E蛋白的帽结合结构对于不同TuMV株系的侵染起了关键作用。4、TuMV-C4和TuMV-CDN1的VPg氨基酸序列进行比对,发现内部有5个差异氨基酸位点,即第52位I/L,第97位E/K,第101位N/D,第105位N/D和第117位I/V。利用重叠延伸PCR技术,以TuMV-C4 VPg质粒为模板,定点突变获得5个单突变体基因。并将这5个单突变体基因构建酵母pGBKT7载体。通过酵母双杂交试验结果表明:pGBKT7:C4 VPg与pGADT7:eIF(iso)4E.a互作过程中,TuMV-C4 VPg的I、II、IV和V差异位点起关键作用;pGBKT7:C4 VPg与pGADT7:eIF(iso)4E.c互作过程中,TuMV-C4 VPg的I差异位点起关键作用。在TuMV和白菜长期的进化中,对于不同的TuMV株系,eIF(iso)4E基因中决定与其相互作用的关键氨基酸也不同,该研究为进一步分析二者的协同进化机制奠定基础。