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目的:本课题拟通过体内和体外实验研究雌激素和氧化应激对小鼠成骨细胞凋亡、增殖和分化等生物学行为的影响,以及在此过程中过氧化物还原酶1型表达的情况;另外通过对小鼠MC3T3-E1前成骨细胞系进行过氧化物还原酶1型基因的敲除和过表达,研究该蛋白对成骨细胞凋亡、增殖和分化等生物学行为的影响;并对雌激素影响成骨细胞过氧化物还原酶1型表达的相关的信号通路进行研究,进一步探讨雌激素和氧化应激调控成骨细胞功能的具体作用机制。方法:1.本研究拟通过使用8周龄雌性小鼠,对其进行卵巢摘除(OVX)手术,制备雌激素缺乏骨质疏松动物模型。通过对小鼠胫骨石蜡切片进行组织化学染色和免疫组织化学染色等方法,观察雌激素缺乏后骨组织的病理学变化以及过氧化物还原酶的表达情况。另外采用体外培养的小鼠MC3T3-E1前成骨细胞系对体内实验结果进行验证。2.通过体外培养的小鼠MC3T3-E1前成骨细胞系,采用CCK8,碱性磷酸酶半定量测试,茜素红S染色,天狼星红染色,流式细胞技术,实时荧光定量PCR和Western-blot蛋白电泳等方法,检测氧化应激对体外培养的MC3T3-E1细胞的凋亡、增殖和分化的影响,以及雌激素对此过程的干预作用。3.通过CRISPR/Cas9等方法,制备过氧化物还原酶1型敲除和过表达的小鼠MC3T3-E1前成骨细胞系,通过上述方法检测过氧化物还原酶1型对体外培养的MC3T3-E1细胞的凋亡、增殖和分化的影响。4.通过生物信息学方法,对雌激素等受体与过氧化物还原酶1型蛋白之间的相互作用关系进行分析,通过KEGG分析筛选可能产生影响的信号通路。5.使用体外培养的小鼠MC3T3-E1前成骨细胞系,在有/无LPS刺激下,通过Western-blot方法,检测成骨细胞内Cyto-c或Trx/ASK1/MAPK信号通路相关蛋白的表达水平,对氧化应激通过PRX1影响成骨细胞凋亡的机制进行研究。6.通过AKT特异性抑制剂LY294002抑制AKT信号通路,以及通过NF-κ B特异性抑制剂PDTC抑制NF-κB信号通路,并采用Western-blot方法检测成骨细胞内AKT1蛋白磷酸化水平,以及NF-κB信号通路中p65蛋白磷酸化水平,研究氧化应激和雌激素影响成骨细胞PRX1表达的相关信号通路。结果:1.小鼠卵巢切除手术4周后,雌激素缺乏导致的骨质疏松症动物模型制备成功。小鼠胫骨近端干骺端组织切片的染色结果显示,与对照组相比,在OVX组表现为骨量减少,骨转换率升高,过氧化物还原酶表达上调。PRX1和PRX5在成骨细胞亚结构中呈现不同的分布模式,PRX1主要在细胞核中积聚,而PRX5主要分布在细胞质中。体外培养的MC3T3-E1细胞实验结果显示,氧化应激可增加成骨细胞PRX1的表达,而雌激素可以减弱该作用结果。2.氧化应激(H2o2/LPS)增加了 MC3T3-E1成骨细胞内过氧化物还原酶1型的表达,引起成骨细胞的凋亡,而雌激素可以通过抑制其表达量从而减弱成骨细胞的凋亡。与对照组相比,H2o2处理组MC3T3-E1细胞的ALP活性以及茜素红S染色结果均降低;实时荧光定量PCR结果显示,H202处理组的Runx2、Ⅰ型胶原和骨钙素的mRNA表达水平均下降;Western-blot结果亦与PCR结果一致。3.制备突变细胞系检测结果显示,与野生型细胞相比,敲除/过表达细胞中PRX1的mRNA及蛋白表达水平明显降低/升高。PRX1敲除后,成骨细胞的ROS水平升高,导致凋亡增多,细胞增殖显著被抑制。且与野生型细胞相比,敲除和过表达的细胞其ALP活性以及茜素红S染色结果均降低。实时荧光定量PCR结果显示,除骨桥蛋白mRNA在过表达细胞中的表达上调外,Runx2、Ⅰ型胶原和骨钙素的mRNA水平均下降。Western-blot结果亦显示PRX1的敲除和过表达均抑制成骨细胞的分化。4.利用STRING数据库信息进行功能注释的结果显示,TLR4/ASK1与MAPK信号通路可能参与PRX1调节的成骨细胞凋亡;雌激素和PRX1可能通过PI3K/AKT和NF-κ B信号通路调节成骨细胞分化功能。5.PRX1-KO细胞在无论是否有LPS刺激时,其Cyto-c的表达水平与PRX1-KO细胞和野生型细胞相比要高得多。在没有LPS刺激的情况下,PRX1-OE细胞中p-ASK1的表达远高于PRX1-KO细胞和野生型细胞,且JNK和p38的表达显着增加;然而,在LPS刺激后,PRX1-OE细胞中p-ASK1、JNK和p38表达降低,而在野生型细胞中的表达显着增加。6.Western-blot结果显示,AKT特异性抑制剂LY294002抑制AKT信号通路后,MC3T3-E1细胞系内AKT1和p65蛋白的磷酸化水平,以及PRX1蛋白的表达水平均有所降低;而NF-κ B特异性抑制剂PDTC抑制NF-κB信号通路后,除p65蛋白的磷酸化水平明显降低外,AKT1蛋白的磷酸化水平,以及PRX1蛋白的表达水平未有改变。结论:1.氧化应激通过刺激MC3T3-E1成骨细胞内PRX1蛋白的表达,引起成骨细胞的凋亡并抑制其分化功能,而雌激素可以通过抑制PRX1蛋白的表达量从而减弱成骨细胞的凋亡,保护成骨细胞的分化功能正常进行。2.过氧化物还原酶家族可能参与雌激素缺乏型骨质疏松症的发展,而该家族的不同成员在这种病理过程中可能扮演不同的角色。其中PRX1是成骨细胞功能的重要调节因子,在细胞的凋亡、增殖和分化过程中起重要作用。3.PRX1敲除后,成骨细胞的ROS水平升高,通过Cyto-c途径影响成骨细胞凋亡;PRX1本身可通过Trx/ASK1/JNK途径影响成骨细胞凋亡。雌激素通过影响成骨细胞表达PRX1从而调控成骨细胞分化,且该作用与AKT1/NF-κB信号通路有关。