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萜类激素甲基法尼酯(MF)是昆虫保幼激素III(JH III)的非环氧化形式,其参与调控甲壳动物的生长、蜕皮、生殖及渗透压调节等多种生理过程,被一致认为是甲壳动物中JH的对等物。MF的生理功能及作用机理一直是甲壳动物内分泌研究的热点,但其在甲壳动物卵巢发育及蜕皮中的作用却存在争议,很有可能因物种的不同而有所区别。由此,本研究对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)MF合成过程中相关酶的基因进行分子克隆和表达分析,并结合MF血淋巴含量水平,对 MF在卵巢发育和蜕皮中的作用进行了探讨,为利用内分泌调控手段解决三疣梭子蟹人工增养殖过程中遇到的“性早熟”及“蜕皮未遂”等现象提供理论依据。 本研究主要内容包括:⑴通过转录组测序筛选得到了54个与三疣梭子蟹内分泌调控相关的基因,这其中也包括一些 MF合成相关酶的基因。利用这些基因的序列信息,我们对三疣梭子蟹的乙酰辅酶 A酰基转移酶(AACT)、法尼焦磷酸合成酶(FPS)和保幼激素酸甲基转移酶(JHAMT)等3个MF合成酶的全长cDNA进行了克隆和生物信息学分析。进一步的组织表达分析显示 PtAACT、PtFPS和PtJHAMT均在大颚器(MO)中表达水平最高,这与 MO是甲壳动物 MF主要合成器官的观点相符。⑵利用dsRNA介导的RNA干扰(RNAi)技术对 PtJHAMT在三疣梭子蟹 MF合成中的作用进行了研究。注射 PtJHAMT和 PtFAMeT的dsRNA均能降低三疣梭子蟹血淋巴中 MF的含量,但 PtJHAMT的表达受 MF合成早期限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A还原酶(HMGR)基因沉默的影响,而 PtFAMeT却不受影响,说明PtJHAMT不仅参与三疣梭子蟹 MF的生物合成,且其催化特异性可能要强于PtFAMeT。⑶分析了眼柄切除(ESA)对三疣梭子蟹血淋巴 MF含量及其合成相关酶基因表达的影响。ESA处理后,三疣梭子蟹血淋巴 MF浓度水平和 MO中 PtHMGR、PtFPS、PtFAMeT和 PtJHAMT表达水平的均显著上升,表明眼柄神经肽类激素可能通过调控 MF合成相关酶基因的表达来抑制 MO中 MF的生物合成。由于PtAACT的表达并未受到 ESA的影响,说明 MO中的乙酰基代谢可能不受眼柄神经肽类激素的调控。⑷在分析PtAACT、PtFPS和PtJHAMT在三疣梭子蟹卵巢发育过程中的表达水平变化时发现,不同 MF合成酶基因的表达水平均在第二次卵巢发育 III期显著上升,与血淋巴 MF含量变化趋势一致;但它们在第一次卵巢发育过程中则有着不同的表达模式:PtJHAMT的表达水平在第一次卵巢发育 III期显著上升,与血淋巴MF含量变化一致,再次说明 PtJHAMT参与催化 MF的合成。PtAACT和 PtFPS的表达水平分别在第一次卵巢发育I期和IV期显著上升,PtAACT可能参与三疣梭子蟹卵巢未发育时期 MO中的物质合成与代谢,而 PtFPS则可能还参与MO中其他类异戊二烯化合物的合成。我们进一步利用离体组织培养及活体注射等实验手段研究了 MF对三疣梭子蟹卵巢发育的影响。两个实验均发现 MF能显著刺激三疣梭子蟹肝胰腺中 Vg的表达,但对卵巢中 Vg的表达水平无明显影响,说明 MF主要是通过促进肝胰腺中Vg的合成来加速卵巢发育。⑸研究了盐度胁迫对三疣梭子蟹血淋巴 MF含量及其合成相关酶基因表达的影响。低盐海水能够快速提升三疣梭子蟹血淋巴 MF的浓度水平,但高盐海水则对血淋巴MF含量并无影响。与之相应,低盐海水能显著提升 PtFPS、PtFAMeT和 PtJHAMT的基因表达水平,但高盐海水则对MF合成相关酶的基因表达并无影响。这说明三疣梭子蟹血淋巴MF含量对低盐胁迫的响应存在着转录水平的调控。