目的膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤之一,全世界每年新发病例大约330000人。严重威胁着人们的健康,始终是恶性肿瘤研究中的一个焦点。两类癌概念的提出为人们从分子与基因水平对膀胱移行细胞癌进行分类与研究提供了新的视角,并为阐明其发病机制与指导治疗,以及推测预后提供了更具科学性的依据,具有重要的理论与现实意义。目前病理分级和临床分期仍是指导治疗、评估治疗方法及临床疗效的主要手段,然而它却无法预判肿瘤的复发和进展,也无法了解致癌机制。因此找到膀胱移行细胞癌相关的特异蛋白可以为研究膀胱癌发病机理提供线索,为肿瘤靶向性治疗提供靶点蛋白,并且可能成为有研究前景的肿瘤标志物侯选蛋白。方法第一部分:实验主要利用手工显微切割联合双向电泳、考马斯亮蓝染色,对高恶性膀胱移行上皮癌和正常移行上皮进行蛋白分离;通过凝胶图像分析软件分析并结合人工比对筛选两块胶中匹配点相对含量的比值大于3的差异蛋白点,为后续质谱分析奠定基础。第二部分:实验对于双向电泳分离出的,凝胶图像选定的蛋白斑点,通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOFTOF-MS)技术对双向凝胶电泳分离出的差异蛋白点进行蛋白质鉴定分析,对得到的肽质量指纹图谱和部分肽段氨基酸序列结合其等电点、分子量、物种来源、修饰情况等参数在Mascot蛋白数据库中检索,进行蛋白的鉴定。生物信息学分析应用互联网上基因本体论(Gene Ontology)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信息资源,结合人工检索文献数据库,对蛋白质的功能进行深入分析。结果1.成功得到了高恶性膀胱移行上皮癌和相应癌旁正常移行上皮的双向电泳图,并且通过凝胶分析软件分析了差异蛋白斑点。从中筛选出20个差异较大(相对含量的比值大于3者)的点。其中11个蛋白在高恶膀胱肿瘤中表达上调,其余9个在正常移行上皮中表达上调。2.利用MALDI-TOF/TOF-MS串联飞行时间质谱仪结合数据库检索对上述20个蛋白点进行鉴定。最后得到符合条件的高恶性膀胱癌与正常移行上皮差异表达蛋白11个。运用蛋白数据库和文献数据库的大量信息,对上述11种蛋白进行相关信息的汇总分析,发现其中5个蛋白在文献中曾经报道过,其表达失调与膀胱癌的发生发展可能相关,包括角蛋白7(CK-7)、角蛋白8(CK-8)、抑制素(Prohibitin)、热休克蛋白60(HSP60)和膜联蛋白V(Annexin A5);6个蛋白目前尚未见到任何膀胱癌的相关资料,包括:蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白(PDIA6)、14-3-3ε蛋白、微管蛋白β4(Tubulin beta-Ⅲ)、Mortalin、结蛋白(Desmin)和膜联蛋白Ⅳ(Annexin A4)。3.对上述11种蛋白质进行GO分析,只有Tubulin beta-Ⅲ缺乏生物学途径的功能注解,其余都有注解。并且分析得到大多数的蛋白在分子功能注解中表现为结合活性;在生物学途径的注解中,主要体现在凋亡调节、信号转导、细胞骨架组成和生物发生方面。与KEGG中的膀胱癌通路相比较,14-3-3蛋白直接参与其中的cell cycle通路,其余的多种蛋白质通过与通路中某些分子的相互作用而间接参与其中。结论1.联合应用手工显微切割与蛋白组学技术,成功建立了膀胱癌与正常上皮差异蛋白组学的研究方法。2.高恶性膀胱移行细胞癌与相应正常上皮存在差异表达的蛋白质。3.进一步的实验需要从基因水平和蛋白水平对鉴定的差异蛋白进行验证,深入研究这些差异表达蛋白不仅有助于阐明膀胱癌发生发展的机制,而且还可能会为膀胱癌提供新的诊断方法和治疗靶点。