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柑橘黄龙病是目前世界柑橘产业上最严重的毁灭性病害,有亚洲种、非洲种和美洲种,亚洲柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama是柑橘黄龙病亚洲种和美洲种唯一已知的媒介昆虫,给全世界柑橘生产带来严重威胁。在我国发生的黄龙病为亚洲种,目前关于其媒介昆虫的研究主要集中在亚洲柑橘木虱上,而对柑橘上其它木虱和其它吸收式口器害虫与黄龙病关系的研究较少。本文利用Nested-PCR技术对柚喀木虱Cacopsylla citrisuga Yang&Li等九种为害柑橘的刺吸式口器害虫进行了检测,明确了柚喀木虱为黄龙病的新媒介昆虫,建立了RAPD分析的最优反应体系和扩增程序,找出了柚喀木虱与亚洲柑橘木虱的差异条带,比较了不同地理种群木虱的遗传距离,并对带菌和不带菌木虱进行了分析,以期得到与柑橘黄龙病基因连锁的RAPD标记,为柑橘黄龙病的防治对策提供新的依据。 主要研究成果如下: 1.从感染黄龙病的柑橘上采集到柚喀木虱等九种柑橘刺吸式口器害虫,利用Nested-PCR对其进行柑橘黄龙病亚洲种病原菌检测,发现从云南瑞丽柠檬病树上采集的柚喀木虱若虫、成虫均有部分样本显示阳性,而其它害虫未显示阳性,说明柚喀木虱携带黄龙病病原菌。传病实验结果表明,从黄龙病树上采集的柚喀木虱若虫接种到健康柠檬苗1个月后导致20%的苗木感染黄龙病,确定柚喀木虱是柑橘黄龙病亚洲种新的媒介昆虫。 2.木虱RAPD-PCR反应体系和扩增程序的优化。在参考一般RAPD分析反应的基础上,经过反复试验,确定木虱RAPD最优反应体系(总体积25μL)为:引物的终浓度为1.2μmol/L,dNTPs的终浓度为0.25 mmol/L,Buffer的终浓度为2.0μmol/L,Taq DNA聚合酶终浓度为0.10 U/μL,模板DNA的终浓度为1.6 ng/μL;RAPD最优扩增程序为:96℃变性30 s,30℃退火60 s,72℃延伸120 s,循环30次,最后72℃延伸6 min。 3.通过对80条引物的初筛和复筛,对于亚洲柑橘木虱最终确定了11条扩增产物清晰、重复性好且多态性高的引物用于PCR扩增,其中扩增谱带数最少的引物为OPD15,只有8条,扩增条带数最多的引物为OPC08,多达24条;对于柚喀木虱最终确定了8条引物,扩增条带数最少的引物为OPF14,扩增出12条谱带;扩增条带数最多的引物为OPD03,多达21条。 4.利用三种引物OPA09、OPM17、OPN20分别对亚洲柑橘木虱和柚喀木虱进行RAPD扩增,可明显区分出这两种木虱,其差异条带分别为3、5、6条。 5.对采自广东、广西、云南、福建、印尼、越南六个地方的不同寄主植物共10个亚洲柑橘木虱种群间进行聚类分析,以遗传相似系数0.70为阈值,将10个种群划分为5类,说明了亚洲柑橘木虱种内遗传背景的复杂性和多样性。