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研究背景：
2型糖尿病（T2DM）是以损伤β-细胞胰岛素的分泌和胰岛素敏感组织出现胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR)为主要特征的代谢性疾病。胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要特征，即细胞胰岛素敏感性下降。线粒体作为细胞进行能量代谢的主要场所，在发生胰岛素抵抗时，线粒体的形态和功能也发生变化，主要表现为：线粒体数量减少、形态异常、酶活性和氧化磷酸化基因表达下降、ATP合成减少及ROS水平升高。现有研究进一步发现线粒体能够调控细胞胰岛素的敏感性。线粒体质量控制体系是线粒体功能得以维持的重要体系，包括了多种质量控制蛋白。GRP75(Glucose-regulatedprotein75)又称为mortalin，mtHSP70(Mitochondrial70kDaheatshockprotein)，是一个高度保守的分子伴侣蛋白，主要定位于线粒体基质。GRP75参与线粒体蛋白的运输、折叠以及成熟。本实验室前期通过在高脂喂养诱导的胰岛素抵抗小鼠细胞模型中，发现脂肪组织中GRP75的表达量发生了显著性的下降，因此我们推测GRP75蛋白可能参与了细胞胰岛素敏感性的调控。本实验拟以小鼠脂肪前体细胞3T3-L1为研究对象，阐明GRP75蛋白对细胞胰岛素敏感性调节的机制。为后期动物学实验的研究提供理论依据。
目的：
1.为了在体外研究GRP75的表达情况是否与细胞胰岛素敏感性相关，构建了脂肪前体细胞3T3-L1GRP75过表达细胞，进行westernblot，检测GRP75表达水平较对照组是否有差异。
2.为了研究GRP75是否对3T3-L1细胞胰岛素敏感性的影响，检测葡萄糖吸收能力，通过将3T3-L1GRP75过表达细胞经诱导分化后，在胰岛素刺激下检测细胞葡萄糖吸收能力,GRP75过表达细胞较各自的对照组是否有差异。
3.为了研究GRP75对3T3-L1细胞线粒体功能的影响，检测GRP75过表达细胞线粒体内源性氧呼吸水平较对照细胞是否有差异
4.为了研究GRP75对3T3-L1细胞线粒体功能的影响，检测GRP75过表达细胞线粒体的MMP、ATP生成能力是否有差异。
5.为了研究GRP75对3T3-L1细胞线粒体功能的影响，检测GRP75过表达细胞线粒体ROS水平较对照细胞是否有差异。
6.为了研究GRP75与胰岛素抵抗发生的分子机制，检测3T3-L1GRP75过表达细胞的JNK(c-JunN-terminalKinase)蛋白的磷酸化水平是否有所改变。
7.为了研究GRP75与胰岛素抵抗发生的分子机制，检测3T3-L1GRP75过表达细胞IRS1蛋白Ser307位点的磷酸化水平是否有所改变。
8.为了研究GRP75与胰岛素抵抗发生的分子机制，检测3T3-L1GRP75过表达细胞中AKT蛋白的Ser473位点和Thr308位点的磷酸化水平是否有所改变。
9.为了研究GRP75与胰岛素抵抗发生的分子机制，检测3T3-L1GRP75过表达细胞中IRS1蛋白的Ser302位点的磷酸化水平是否有所改变。
方法:
1.搜索NCBI数据库设计引物拉取GRP75cDNA（来自3T3-L1细胞），构建携带抗G418抗性基因的过表达载体并转染3T3-L1细胞，使用G418进行筛选获得多个GRP75成功高表的细胞克隆。
2.将3T3-L1GRP75过表达细胞培养至生长面积达到80%之后，将细胞进行分化，分化成功后检测胰岛素刺激下的葡萄糖吸收水平在对照组细胞之间的差异。
3.3T3-L1GRP75过表达细胞培养至生长面积达到80%时利用试剂盒对线粒体功能进行检测，分析GRP75过表达之后线粒体功能与正常对照之间的差异性。
a)3T3-L1GRP75过表达细胞的膜电位水平的检测：试剂盒TMRM荧光染料检测。
b)3T3-L1GRP75过表达细胞的ATP检测；试剂盒分析ATP生成能力
c)3T3-L1GRP75过表达细胞的ROS检测：试剂盒细胞线粒体内ROS水平
4.3T3-L1GRP75过表达细胞的胰岛素信号通路蛋白的检测，主要检测AKT蛋白Ser473位点和Thr308位点的磷酸化水平以及IRS1蛋白和Ser307位点磷酸化水平。
5.3T3-L1GRP75过表达细胞中与胰岛素信号通路调控有关的通路分析。
6.统计学分析：应用SPSS19.0软件分析GRP75过表达细胞与对照细胞间的上述差异。
结果:
1.胰岛素诱导的葡萄糖吸收能力测试显示3T3-L1GRP75过表达细胞相对于对照细胞具有更高的葡萄糖吸收能力，提示GRP75过表达细胞具有更高的胰岛素敏感性。
2.线粒体功能检测试剂盒显示3T3-L1GRP75过表达细胞线粒体ROS水平较对照细胞有显著性的下降。
3.线粒体功能检测试剂盒显示3T3-L1GRP75过表达细胞，线粒体的膜电位水平、ATP生成能力均有显著性升高。
4.Westernblot实验显示3T3-L1GRP75过表达细胞JNK蛋白的磷酸化水平下降，说明JNK蛋白在GRP75蛋白高表之后JNK蛋白活化受到抑制。
5.Westernblot实验显示3T3-L1GRP75过表达细胞中，AKT蛋白的Ser473位点和Thr308和IRS1302位点的磷酸化水平水平有一定程度地上升。
6.Westernblot实验显示3T3-L1GRP75过表达细胞IRS1蛋白的Ser307位点的磷酸化水平下降。
2型糖尿病（T2DM）是以损伤β-细胞胰岛素的分泌和胰岛素敏感组织出现胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR)为主要特征的代谢性疾病。胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要特征，即细胞胰岛素敏感性下降。线粒体作为细胞进行能量代谢的主要场所，在发生胰岛素抵抗时，线粒体的形态和功能也发生变化，主要表现为：线粒体数量减少、形态异常、酶活性和氧化磷酸化基因表达下降、ATP合成减少及ROS水平升高。现有研究进一步发现线粒体能够调控细胞胰岛素的敏感性。线粒体质量控制体系是线粒体功能得以维持的重要体系，包括了多种质量控制蛋白。GRP75(Glucose-regulatedprotein75)又称为mortalin，mtHSP70(Mitochondrial70kDaheatshockprotein)，是一个高度保守的分子伴侣蛋白，主要定位于线粒体基质。GRP75参与线粒体蛋白的运输、折叠以及成熟。本实验室前期通过在高脂喂养诱导的胰岛素抵抗小鼠细胞模型中，发现脂肪组织中GRP75的表达量发生了显著性的下降，因此我们推测GRP75蛋白可能参与了细胞胰岛素敏感性的调控。本实验拟以小鼠脂肪前体细胞3T3-L1为研究对象，阐明GRP75蛋白对细胞胰岛素敏感性调节的机制。为后期动物学实验的研究提供理论依据。
目的：
1.为了在体外研究GRP75的表达情况是否与细胞胰岛素敏感性相关，构建了脂肪前体细胞3T3-L1GRP75过表达细胞，进行westernblot，检测GRP75表达水平较对照组是否有差异。
2.为了研究GRP75是否对3T3-L1细胞胰岛素敏感性的影响，检测葡萄糖吸收能力，通过将3T3-L1GRP75过表达细胞经诱导分化后，在胰岛素刺激下检测细胞葡萄糖吸收能力,GRP75过表达细胞较各自的对照组是否有差异。
3.为了研究GRP75对3T3-L1细胞线粒体功能的影响，检测GRP75过表达细胞线粒体内源性氧呼吸水平较对照细胞是否有差异
4.为了研究GRP75对3T3-L1细胞线粒体功能的影响，检测GRP75过表达细胞线粒体的MMP、ATP生成能力是否有差异。
5.为了研究GRP75对3T3-L1细胞线粒体功能的影响，检测GRP75过表达细胞线粒体ROS水平较对照细胞是否有差异。
6.为了研究GRP75与胰岛素抵抗发生的分子机制，检测3T3-L1GRP75过表达细胞的JNK(c-JunN-terminalKinase)蛋白的磷酸化水平是否有所改变。
7.为了研究GRP75与胰岛素抵抗发生的分子机制，检测3T3-L1GRP75过表达细胞IRS1蛋白Ser307位点的磷酸化水平是否有所改变。
8.为了研究GRP75与胰岛素抵抗发生的分子机制，检测3T3-L1GRP75过表达细胞中AKT蛋白的Ser473位点和Thr308位点的磷酸化水平是否有所改变。
9.为了研究GRP75与胰岛素抵抗发生的分子机制，检测3T3-L1GRP75过表达细胞中IRS1蛋白的Ser302位点的磷酸化水平是否有所改变。
方法:
1.搜索NCBI数据库设计引物拉取GRP75cDNA（来自3T3-L1细胞），构建携带抗G418抗性基因的过表达载体并转染3T3-L1细胞，使用G418进行筛选获得多个GRP75成功高表的细胞克隆。
2.将3T3-L1GRP75过表达细胞培养至生长面积达到80%之后，将细胞进行分化，分化成功后检测胰岛素刺激下的葡萄糖吸收水平在对照组细胞之间的差异。
3.3T3-L1GRP75过表达细胞培养至生长面积达到80%时利用试剂盒对线粒体功能进行检测，分析GRP75过表达之后线粒体功能与正常对照之间的差异性。
a)3T3-L1GRP75过表达细胞的膜电位水平的检测：试剂盒TMRM荧光染料检测。
b)3T3-L1GRP75过表达细胞的ATP检测；试剂盒分析ATP生成能力
c)3T3-L1GRP75过表达细胞的ROS检测：试剂盒细胞线粒体内ROS水平
4.3T3-L1GRP75过表达细胞的胰岛素信号通路蛋白的检测，主要检测AKT蛋白Ser473位点和Thr308位点的磷酸化水平以及IRS1蛋白和Ser307位点磷酸化水平。
5.3T3-L1GRP75过表达细胞中与胰岛素信号通路调控有关的通路分析。
6.统计学分析：应用SPSS19.0软件分析GRP75过表达细胞与对照细胞间的上述差异。
结果:
1.胰岛素诱导的葡萄糖吸收能力测试显示3T3-L1GRP75过表达细胞相对于对照细胞具有更高的葡萄糖吸收能力，提示GRP75过表达细胞具有更高的胰岛素敏感性。
2.线粒体功能检测试剂盒显示3T3-L1GRP75过表达细胞线粒体ROS水平较对照细胞有显著性的下降。
3.线粒体功能检测试剂盒显示3T3-L1GRP75过表达细胞，线粒体的膜电位水平、ATP生成能力均有显著性升高。
4.Westernblot实验显示3T3-L1GRP75过表达细胞JNK蛋白的磷酸化水平下降，说明JNK蛋白在GRP75蛋白高表之后JNK蛋白活化受到抑制。
5.Westernblot实验显示3T3-L1GRP75过表达细胞中，AKT蛋白的Ser473位点和Thr308和IRS1302位点的磷酸化水平水平有一定程度地上升。
6.Westernblot实验显示3T3-L1GRP75过表达细胞IRS1蛋白的Ser307位点的磷酸化水平下降。