铝毒害是酸性土壤中限制牧草及农作物生长和产量的关键因子。铝在酸性土壤中主要以离子形式存在并富集在植物根尖的分生区和伸长区。游离的铝离子能通过诱发脂质产生自由基来引起活性氧损伤,抑制有丝分裂及DNA合成以阻止细胞分裂;通过改变细胞壁结构以降低延展性来抑制细胞伸长,最终抑制植物根系的生长。发育调节质膜多肽（Developmentally-regulated plasma membrane polypeptide,DREPP）是一类植物特异性蛋白,研究表明DREPP家族蛋白参与了植物对生物和非生物胁迫的响应与调控。丹波黑大豆（Glycine max cv.Tamba）是原产于日本的耐铝大豆品种。本研究室在前期试验中测定了丹波黑大豆在酸性土壤条件下的根尖芯片组数据及铝胁迫条件下的转录组数据,发现GmDREPP基因的表达量均明显上调,由此推测该基因可能与植物耐铝相关,但其耐铝功能尚不明确。本研究通过克隆GmDREPP基因并对其功能进行鉴定,以期为牧草耐铝育种提供理论基础。本研究以耐铝丹波黑大豆为材料,通过分子克隆技术从丹波黑大豆中克隆获得GmDREPP基因的CDS序列,运用实时荧光定量PCR研究GmDREPP基因在丹波黑大豆中的组织表达特性及其对铝胁迫的响应特点。而后构建植物表达载体p CXSN-GmDREPP,成功遗传转化烟草（Nicotiana tabacum）。对转基因烟草阳性植株进行RT-PCR分析,选取三个表达较高的转基因株系（GmDREPP-2,GmDREPP-4,GmDREPP-5）进行耐铝功能鉴定及机理分析。主要研究结果如下:（A）丹波黑大豆GmDREPP基因的生物信息学分析及q RT-PCR定量分析本研究从丹波黑大豆中克隆获得GmDREPP基因,该基因序列全长624 bp,编码207个氨基酸。GmDREPP蛋白位于细胞膜表面,无跨膜区及信号肽,分子式为C1028H1646N254O346S1,理论等电点为4.95;氨基酸组成中谷氨酸占比最高（21.3%）,赖氨酸和丙氨酸占比17.4%、10.1%,精氨酸和色氨酸占比最低（0.5%）;该蛋白的正、负电荷的残基均为0;不稳定系数50.26（>40）,为不稳定蛋白;1～177位氨基酸是其功能结构域,为DREPP家族所特有的保守区域;构建进化树结果表明GmDREPP在同一科中同源性很高。qRT-PCR定量结果表明,铝胁迫下GmDREPP在丹波黑大豆的根、茎、叶、子叶中均有表达,根中又以根尖的表达量最高。根系GmDREPP的表达水平随Al3+浓度增加显著上升且在达到50μmol/L后无显著变化。（B）丹波黑大豆GmDREPP基因表达载体的构建及遗传转化烟草本研究从丹波黑大豆中克隆获得GmDREPP基因的CDS序列,构建植物表达载体p CXSN-GmDREPP,并通过农杆菌对烟草进行遗传转化,培养获得烟草植株42株。提取DNA进行PCR检测,获得7株阳性植株;提取RNA进行RT-PCR检测,获得5株有表达活性的植株;从中选取三个阳性植株培育转基因株系进行耐铝性分析。（C）转基因烟草的耐铝鉴定用50μmol/L Al3+处理野生型烟草及三个阳性转基因株系两周后,测定根系相对伸长量,结果显示转基因烟草根的相对伸长量最高可达野生型2.6倍（P<0.01）;在50μmol/L Al3+处理后,对根尖进行伊文思蓝和苏木精染色,结果显示转基因烟草根尖颜色较浅,说明转基因烟草受铝毒害较轻。表明过表达GmDREPP基因增强了烟草的耐铝性。（D）转基因烟草提高耐铝性机理分析以烟草耐铝标志性基因Nt ALS3和Nt MATE为对象,在铝处理后,转基因烟草Nt ALS3和Nt MATE的相对表达量分别提高1.9倍（P<0.01）和1.7倍（P<0.01）以上,且与野生型烟草相比,转基因植株根系Nt ALS3和Nt MATE的表达量分别上调1.4～1.6倍（P<0.01）和1.8～2.0倍（P<0.01）;转基因烟草根系柠檬酸分泌量提升达2.9倍（P<0.01）;铝处理后,转基因烟草根系过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性显著上升（P<0.01）,分别可达WT的1.8倍和1.9倍以上;此外,根系中MDA的含量最高可较WT降低56%（P<0.01）。可见,过表达GmDREPP可以通过上调耐铝关键基因Nt ALS3和Nt MATE的表达,并通过显著提高根系柠檬酸分泌、抗氧化酶SOD及POD活性及降低MDA含量来增强转基因烟草的耐铝性。综上所述,本研究从耐铝植物丹波黑大豆中克隆GmDREPP基因。该基因是DREPP基因家族的一员,序列全长624 bp,编码207个氨基酸。GmDREPP蛋白位于细胞膜表面,具有DREPP家族所特有的保守结构域。通过转GmDREPP基因烟草耐铝试验,证明了该基因是耐铝基因,可以为紫花苜蓿等牧草的耐铝品种培育提供基因资源。