MicroRNA(miRNA)是一类大小约为21～25nt,存在于动植物体内的内源性非编码的小RNA分子。它通过与mRNA序列特异性匹配来调节靶基因的表达。SBP-box是植物特有的一类转录因子,模式植物中研究表明,miR156s靶向调控SBP-box的部分成员,并在植物生长和发育中发挥重要作用。我们前期的研究发现,miR156s与SBP在葡萄果实生长发育过程中均有一定的表达,但其在葡萄果实发育与成熟中的作用并不清楚,为此,本研究开展了葡萄Vv-miR156s家族成员的鉴定、靶基因的预测与验证,分析其在果实发育过程中表达模式的动态变化,及其应答ABA、NAA调控果实转色与成熟的作用模式;此外,对Vv-miR156s的靶基因VvSBP9的生物学功能进行验证。主要研究结果如下:1.利用qRT-PCR及miR-RACE技术克隆到‘魏可’Vv-miR156s成员的成熟体及前体序列,分析成熟体序列的相似性,可将Vv-miR156s分为五类:Vv-miR156a、Vv-miR156b/c/d、Vv-miR156e、Vv-miR156f/g/i 和 Vv-miR156h。与 miRBase 中‘黑比诺’葡萄的序列比对分析发现,两种葡萄品种的前体序列相同,但成熟体序列具有差异,且该差异是由于成熟体序列在5’端的位移造成的。对‘魏可’Vv-miR156s家族成员的生物信息学分析发现,其成熟体序列具有较高的保守性,前体具有稳定的二级茎-环结构,前体基因均匀地分布在葡萄的6条染色体上;其家族进化特征与定位信息相符合,即位于同一染色体上的序列被聚为一类。靶基因预测结果表明,Vv-miR156s大多数靶基因属于转录因子SBP-box中的成员。2.为了深入认识Vv-miR156s靶基因SBP-box成员及非靶SBP-box成员在果实发育与成熟中的作用差异,对葡萄转录因子数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中的存在的SBP-box家族成员进行系统地生物信息学分析。从葡萄转录因子数据库中获得19个SBP-box成员,其中有10个成员被预测为Vv-miR156s的靶基因。分析发现,SBP-box成员不均匀地分布在葡萄13条染色体上,编码115-981个氨基酸,分子量在13KD-109KD之间,大多数为碱性、亲水、不稳定蛋白,且均含有完整的、高度保守的SBP保守结构域;二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,且主要定位在细胞核中;芯片数据分析表明,VvSBPs基因的表达显示出组织和器官特异性模式,且大部分SBP基因在浆果果皮、果肉和种子中的某些生长发育阶段具有较高表达。此外,该家族中不同成员的启动子中均含有与果实发育与成熟相关的motif作用元件,且其含有的元件个数存在差异,暗示着其功能的差异性;对其在葡萄果实发育中8个重要时期的时空表达及其应答激素的表达模式分析表明,约9个成员(包括被预测到的Vv-miR156s的5个靶基因)可能促进了葡萄果实的成熟过程;约7个成员(包括被预测到的Vv-miR156s的5个靶基因)可能促进了葡萄果实的生长发育,但抑制了果实的转色与成熟过程。由此推测,包括Vv-miR156s的靶基因在内的所有VvSBPs成员在果实生长发育过程中具有重要作用。3.利用 PPM-RACE 和 RLM-RACE 分别验证到 Vv-miR156a、Vv-miR156b/c/d、Vv-miR156e、Vv-miR156f/g/i对VvSBP(2、9、10、16)的裂解作用,并鉴定了裂解作用强度及其位点;采用qRT-PCR技术分析了 Vv-miR156s及其靶VvSBP(2、9、10、16)在葡萄果实发育与成熟过程中8个重要时期的时空表达模式,发现Vv-miR156s能够负调控VvSBP(2、9、10、16)的表达。通过ABA、NAA在果实转色前1周处理,进一步验证Vv-miR156s及靶基因在葡萄果实成熟中的作用。该研究结果表明,在Vv-miR156s的靶向作用下,VvSBP2和VvSBP16可能正调控果实的转色与成熟,而VvSBP9和VvSBP10可能抑制了果实的转色与成熟。4.以‘魏可’葡萄为试材,克隆得到可能抑制果实转色与成熟的,Vv-miR156s的靶基因VvSBP9,该基因开放阅读框(ORF)区长1050bp,编码349个氨基酸。利用农杆菌介导的叶盘法将VvSBP9基因转化烟草,初步验证其功能。转基因植株花的色泽呈现条纹状,且植株变高、茎变粗、节间变长。此外,过表达VvSBP9能够下调转基因植株中花色苷合成基因NtCHI和NtCHS的表达。说明VvSBP9能够通过抑制花色苷合成基因NtCHI和NtCHS的表达来控制花色苷的合成,进而影响花瓣的色泽。