研究背景糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发病是由β-细胞渐进性的衰退或功能障碍引起的胰岛素合成和分泌不足所引起,传统的胰岛素和口服降糖药治疗只能对症处理,并不能阻止胰岛β细胞功能的进行性衰竭和糖尿病并发症的发生发展。因此,糖尿病的再生替代治疗已成为世界范围研究者关注的焦点。糖尿病再生替代治疗有胰腺移植、胰岛移植以及干细胞移植治疗。胰腺移植和胰岛移植由于供体的缺乏和免疫排异反应而制约了其在临床的发展。在糖尿病的干细胞治疗领域,骨髓间充质干细胞引起人们更多的关注。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于骨髓中非造血干细胞的一种干细胞,是由中胚层发育的早期细胞,具有多向分化潜能,不仅能分化为造血实质,支持造血,还可以分化为多种造血以外的组织细胞,MSCs已被证明可在体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等,由此可见,其分化潜能不仅仅局限于中胚层组织,而且在特定的条件下可以向内胚层和外胚层的组织细胞分化。另外,已有动物实验证明血液中的MSCs具有定向迁移至受损器官或组织的能力,如MSCs可定向迁移并停留于骨、软骨损伤部位、心肌梗死或缺血性脑损伤等部位,故移植MSCS后可明显促进病变局部骨、软骨、肌肉、神经等细胞的修复重建。所以,近年来,骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)的功能作用和临床应用成为医学界普遍关注的研究热点,其已经成为一种理想的组织工程的种子细胞。BM-MSCs不仅具有取材方便、扩增迅速的特点,更重要的一点在于患者可以利用自身骨髓来源的干细胞治疗疾病,实现真正的自体移植,从而克服移植排斥反应。因此,MSCs作为一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞,已经成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源。目前,多项研究已证实了骨髓源性干细胞在特定条件下培养,可被诱导分化成胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs)。Tang DQ等的研究表明,小鼠骨髓间充质干细胞可在体外经诱导分化为表达一系列胰岛β细胞相关基因(胰岛素Ⅰ和Ⅱ,GLUT-2,葡萄糖激酶,胰岛淀粉样多肽,PDX-1等),此细胞接受葡萄糖刺激后,免疫细胞化学和电镜证实有胰岛素和C肽的表达,把这些IPCs形成的集合体用微囊包裹,移植到高血糖大鼠肾包膜内后,空腹及腹腔糖耐量试验均有所改善。Baneriee等的实验表明,骨髓在高血糖状态下仍保留了它的干细胞性质。这些研究表明,糖尿病人有望利用自身的BM-MSCs来治疗DM。在此基础之上,本研究选取糖尿病大鼠的骨髓,建立适宜的BM-MSCs体外培养体系,并通过形态学特征、表面标志以及多向分化功能等方面进行鉴定,并证实高糖状态下BM-MSCs的分化能力;同时在糖尿病大鼠模型中,同种异体移植糖尿病大鼠的BM-MSCs,观察BM-MSCs移植对STZ诱导糖尿病大鼠的治疗作用并进一步探讨其可能的作用机制。本研究由两部分组成:第一部分探讨从大鼠骨髓中分离、培养BM-MSCs的方法,并对高血糖状态下BM-MSCs的分化能力进行鉴定和证实,第二部分观察BM-MSCs移植对STZ诱导糖尿病大鼠的作用。目的(1)探索从糖尿病大鼠骨髓中分离、培养MSCs的方法,建立大鼠BM-MSCs的体外培养体系,为后续的干细胞研究提供稳定的细胞模型。(2)将体外培养的BM-MSCs移植入糖尿病大鼠体内,探讨BM-MSCs移植是否有助于糖尿病的治疗及可能的作用机制。方法(1)采用经典的全骨髓贴壁法培养BM-MSCs,在含10%胎牛血清的DMEM-LG培养基中进行培养,获得大鼠BM-MSCs。通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记(CD44,CD34,CD45,CD90)等鉴定MSCs特征。取三代(P3)的BM-MSCs用于后续实验。(2)以BrdU标记BM-MSCs,台盼蓝染色测定BrdU标记后细胞活率。建立STZ诱导的糖尿病大鼠的模型,实验大鼠共分为3组,正常对照组大鼠10只(无DM,尾静脉注射0.1M柠檬酸缓冲液);糖尿病大鼠分为2组:DM对照组10只(DM,但不移植MSCs);实验组10只(DM,移植MSCs)。观察移植术后三组大鼠的体重、血糖、血浆胰岛素水平变化情况,并取各组胰腺组织制备切片,通过免疫组化、免疫荧光双标记技术观察大鼠胰腺移植细胞情况。结果(1)48h后可见散在贴壁细胞,形态呈成纤维样,72h后通过全量换液去除残留的各种血细胞,贴壁生长的MSCs呈单个分散存在或形成几个细胞的克隆,7～10天后,贴壁细胞数目明显增多,呈梭形或长多边形,形态不完全均一,但细胞排列整齐,边界清晰,在培养瓶中分布及生长均匀。原代培养10～14天细胞可达80～90%融合,0.25%胰蛋白酶常规消化,按1:2的比例传代,传代后的BM-MSCs形态与原代基本相似,经过3代后BM-MSCs基本达到形态均一。流式细胞术细胞表型的鉴定分析显示BM-MSCs高表达CD44、CD90,而CD34、CD45、MHCI低表达或表达阴性,诱导分化实验表明BM-MSCs在体外具有向中胚层3种细胞(骨、软骨和脂肪细胞)及外胚层细胞(神经细胞)分化的能力,表明我们分离培养的BM-MSCs为具有均一细胞表面特征的细胞群,是一群区别于造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)并具有多向分化潜能的非定向干细胞。(2)BrdU标记的BM-MSCs免疫荧光染色后可见细胞核为DAPI/BrDu双染,即蓝/绿双染,标记阳性率89.5%。台盼蓝染色测定BrdU标记后细胞活率,可见标记后细胞活率99%±0.6%。Wistar大鼠按60 mg/kg体重尾静脉注射1%STZ溶液,造模成功率为22/25。实验过程中,正常对照组血糖保持在(4.6±0.7～5.6±1.0)mmol/L,DM对照组血糖在(24.2±2.3～27.8±2.1)mmol/L,实验组血糖在(17.7±3.9～26.1±3.2)mmol/L。其中,在BM-MSCs移植后,实验组较DM对照组血糖有下降趋势,尤其在第45天时,实验组较DM对照组血糖明显降低(17.7 mmol/L±3.9 vs 27.8 mmol/L±2.1,P＜0.05)。各时间点,实验组、DM对照组血糖均高于正常组(均P＜0.05)。在体重方面,正常对照组体重逐渐增加,DM对照组体重降低,而实验组体重变化不明显;在第45天时,DM对照组较正常对照组体重明显降低(133.3g±13.1 vs.358.8g±21.6,P＜0.05);另外,实验组较DM对照组体重亦显著增加(232.7g±19.7 vs 133.3g±13.1,P＜0.05)。在第45天时实验结束时,各组血浆胰岛素水平存在差异。其中,DM对照组较正常对照组血浆胰岛素水平明显降低(10.3mIU/ml±2.3 vs.33.2mIU/ml±3.8,P＜0.05);实验组较DM对照组血浆胰岛素水平则显著增加(19.8 mIU/ml±4.8 vs 10.3mIU/ml±2.3,P＜0.05)。各组胰腺组织免疫组织化学染色观察结果显示,与DM对照组比较,实验组胰岛易见,体积小、多数位于导管附近,提示多为来源于胰腺导管上皮的新生胰岛,与正常对照组胰岛比较,实验组单个新生胰岛面积和直径均明显小于正常对照组(P＜0.05)。另外,实验组免疫荧光双标记染色结果显示,BrdU标记的BM-MSCs移植后可在胰腺组织中出现,多分布在胰腺导管周围,细胞核呈绿色荧光,提示有BM-MSCs归巢于胰腺;同时,可观察到少数绿色细胞核、红色细胞浆的双染细胞,说明这种细胞为移植的BM-MSCs,且能够分泌胰岛素,提示有少量归巢于胰腺的BM-MSCs转分化为胰岛素分泌细胞。结论(1)利用全骨髓贴壁法分离培养BM-MSCs,可获得糖尿病大鼠的BM-MSCs。培养的BM-MSCs表型均一,并具有多向分化潜能,可用于进一步的组织工程、细胞和分子生物学研究。(2)培养的BM-MSCs经尾静脉移植于STZ诱导的糖尿病大鼠体内,改善了大鼠的高血糖状态,有少部分可归巢于胰腺,横向分化为胰岛素分泌细胞,并可引起胰岛细胞再生。提示BM-MSCs分离、扩增后再移植治疗糖尿病是可行的。